רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
Summary
הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Abstract
הערכה של רמת הסידן הקדם-סינפטי היא משימה מרכזית בחקר ההולכה הסינפטית, שכן כניסת סידן לתא הקדם-סינפטי מעוררת מפל של אירועים המובילים לשחרור מוליכים עצביים. יתר על כן, שינויים ברמות הסידן הקדם-סינפטי מתווכים את פעילותם של חלבונים תוך-תאיים רבים וממלאים תפקיד חשוב בגמישות הסינפטית. חקר איתות הסידן חשוב גם למציאת דרכים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות. הצומת העצבי-שרירי הוא מודל מתאים לחקר הפלסטיות הסינפטית, שכן יש לו רק סוג אחד של נוירוטרנסמיטר. מאמר זה מתאר את השיטה להעמסת צבע רגיש לסידן דרך צרור העצבים החתוך לתוך קצות העצבים המוטוריים של העכברים. שיטה זו מאפשרת להעריך את כל הפרמטרים הקשורים לשינויים בסידן תוך תאי, כגון רמת הסידן הבסיסית וסידן חולף. מאחר שזרימת הסידן מהחלק החיצוני של התא אל קצות העצבים וקשירתו/אי-כריכתו לצבע הרגיש לסידן מתרחשות בטווח של אלפיות השנייה הבודדות, נדרשת מערכת הדמיה מהירה לתיעוד אירועים אלה. ואכן, מצלמות במהירות גבוהה משמשות בדרך כלל לרישום של שינויי סידן מהירים, אך יש להם פרמטרים ברזולוציית תמונה נמוכה. הפרוטוקול המוצג כאן לרישום סידן חולף מאפשר רזולוציה מרחבית-טמפורלית טובה ביותר המסופקת על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Introduction
הבעיה של מדידת גלי סידן מהירים בתאים מעוררים היא אחד ההיבטים החשובים והמאתגרים ביותר בחקר העברת אותות במערכת העצבים המרכזית וההיקפית. יוני סידן ממלאים תפקיד חשוב בהפעלת שחרור מוליכים עצביים, פלסטיות סינפטית וויסות הפעילות של חלבונים תוך-תאיים שונים 1,2,3,4,5. חקר איתות סידן חשוב גם למציאת דרכים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות6. כדי למדוד שינויים ברמות הסידן, צבעים פלואורסצנטיים רגישים לסידן נמצאים בשימוש נפוץ, ושינויים ברמת הפלואורסצנטיות שלהם מנותחים 7,8,9.
העמסה של צבעי סידן לתוך תאים יכולה להיות מושגת בדרכים שונות. בעיקר, צבעים המיועדים לתאים משמשים10,11. עם זאת, במקרה כזה, זה לא רק קשה לשלוט על הריכוז של צבע בתוך התא, אבל זה גם קשה לבחור תאי יעד לטעינה. שיטה זו אינה ישימה לחקר קצות עצבים היקפיים מכיוון שהצבע נכנס לתאים פוסט-סינפטיים. במקום זאת, צבעים אטומים לתאים מתאימים יותר להכנות כאלה. במקרה זה, הצבעים מועברים לתאים על ידי מיקרו הזרקה או דרך פיפטה טלאי12,13,14. יש גם שיטה של העמסה דרך גדם עצב. השיטה השנייה מתאימה ביותר לתכשירי צומת נוירומוסקולרי 15,16,17,18,19,20. זה מאפשר ביצוע צביעה רק עבור תאים מעניינים. למרות ששיטה זו אינה מספקת הערכה מדויקת של ריכוז הצבע בתא היעד, ניתן להעריך את הריכוז בקירוב על ידי השוואת רמת הפלואורסצנטיות של התאים במנוחה בתמיסות עם ריכוז ידוע של סידן21. במחקר זה מוצג שינוי של שיטה זו המיושמת על סינפסות של יונקים.
כניסת סידן בשלב הדה-פולריזציה של פוטנציאל הפעולה היא תהליך מהיר, במיוחד בצומת הנוירומוסקולרי; לכן, לרישום שלה, ציוד מתאים נדרש1. מחקר שנערך לאחרונה באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש למתח הראה כי משך פוטנציאל הפעולה בסינפסה ההיקפית של עכבר הוא כ-300 μs22. לסידן חולף, המוערך באמצעות צבעים רגישים לסידן בסינפסות ההיקפיות של הצפרדע, יש משך זמן ארוך יותר: זמן העלייה הוא כ 2-6 ms וזמן הדעיכה הוא כ 30-90 ms, בהתאם צבע סידן בשימוש23,24. כדי למדוד תהליכים מהירים בעזרת צבעים פלואורסצנטיים, מצלמות CCD או CMOS משמשות בדרך כלל, עם מטריצות CCD מהירות ורגישות. עם זאת, למצלמות אלה יש את החיסרון של רזולוציה נמוכה, המוגבלת על ידי גודל האלמנטים הרגישים של המטריצה25,26,27,28. למצלמות המהירות ביותר עם רגישות מספקת כדי לתעד הן פוטנציאל פעולה והן טרנזיינטים של סידן בתגובה לגירוי בתדר נמוך של תאים יש תדר סריקה של 2,000 הרץ, ומטריצה עם ממד של 80 x 8029. כדי לקבל אותות עם רזולוציה מרחבית גבוהה יותר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת, במיוחד אם יש צורך להעריך כמה שינויים נפחיים האות30,31,32. אבל יש לזכור כי מיקרוסקופיה קונפוקלית יש מהירות סריקה גבוהה במצב סריקת קו, אבל יש עדיין מגבלות משמעותיות על מהירות ההקלטות של תהליכים מהירים בעת בניית תמונה מרחבית33. ישנם מיקרוסקופים קונפוקליים המבוססים על דיסקים מסתובבים של Nipkow (מיקרוסקופיה לסריקת חריצים) וסורקי מערך רב-נקודתיים, בעלי מהירות סריקה גבוהה יותר. יחד עם זאת, הם נחותים מהמיקרוסקופים הקונפוקליים הקלאסיים בסינון תמונה קונפוקלית (חורים מוצלבים למיקרוסקופים עם דיסק Nipkow)32,34,35. הדמיה קונפוקלית עם סריקת תהודה יכולה גם לספק רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה הנדרשת למדידות טמפורליות גבוהות36. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי רישום של תגובות פלואורסצנטיות חלשות במהירות סריקה גבוהה בעת שימוש בסורקי תהודה דורש גלאים רגישים ביותר כגון גלאים היברידיים36.
מאמר זה מציג שיטה להגדלת הרזולוציה הזמנית של אותות המוקלטים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר (LSCM) תוך שמירה על הרזולוציה המרחבית37. השיטה הנוכחית היא פיתוח נוסף של השיטות שתוארו קודם לכן והועברו לפלטפורמת LSCM38,39,40. גישה זו אינה דורשת שינויים בחומרת המיקרוסקופ ומבוססת על יישום אלגוריתם להקלטת אותות פלואורסצנטיים מעוררים מעת לעת עם שינוי זמן ביחס לרגע הגירוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה להעמסת צבע רגיש Ca2+ לתוך קצות העצבים של העכבר דרך גדם העצב ולרישום מעבר סידן מהיר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מוצגת במאמר זה. כתוצאה מיישום שיטת העמסה זו, לרוב הסינפסות הממוקמות קרוב לגדם העצב הייתה רמה מספקת של פלואורסצנטיות כדי לאפשר רישום של כניסת סידן לקצות העצבים בתגובה לג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקרים פלואורסצנטיים של עבודה זו בוצעו בתמיכה כספית של מענק קרן המדע הרוסית (פרויקט מס ’19-15-00329). השיטה פותחה במימון המשימה הממשלתית עבור המרכז המדעי FRC קאזאן של RAS ААААА-А18-118022790083-9. המחקר פותח תוך שימוש בציוד של מרכז המחקר הפדרלי “מרכז מדעי קאזאן של RAS”. המחברים מבקשים להודות לד”ר ויקטור א. איליין על הקריאה הביקורתית של כתב יד זה.
Materials
| Capillary Glass | Clark Electromedical instruments, UK | GC150-10 | |
| Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Germany | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller P 97 | Sutter Instrument, USA | P-97 | |
| Flow regulator | KD Medical GmbH Hospital Products, Germany | KD REG | Disposable infusion set with Flow regulator |
| HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100mL |
| Illumination system Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Germany | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | ||
| Las X software | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Magnetic Holder with Suction Tubing | BIOSCIENCE TOOLS, USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Latvia | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | Fine science tools, Canada | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latvia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium salt | Molecular Probes, USA | O6806 | 500 μg |
| Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10 µL |
| Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10 µL |
| Plasticine | local producer | ||
| Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40 mm |
| Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel | |
| Stereomicroscope, Leica M80 | Leica Microsystems , Germany | ||
| Suction electrode | Kazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. – No. 9 (40) Part 3. – P. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning, USA | ||
| Syringe | local producer | 0.5 mL | |
| Syringe | local producer | 60 mL |
References
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
- Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
- Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
- Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
- Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
- Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
- Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
- Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
- Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201 (2009).
- Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
- Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
- Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
- Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
- Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
- Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
- Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250 (2007).
- Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
- Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
- Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302 (2021).
- Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29 (2015).
- DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
- Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
- Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
- Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
- Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
- Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
- Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
- Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , (2011).
- Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
- Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
- Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
- Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
- Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
- Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
- Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
- Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122 (2017).
- Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
- Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
- Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. -. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124 (2011).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482 (2018).
- Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
- Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
- Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. 생화학. 35 (27), 8824-8835 (1996).
- Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
- Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
- Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621 (2016).
- Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031 (2021).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).
