Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

Le problème de la mesure des ondes de calcium rapides dans les cellules excitables est l’un des aspects les plus importants et les plus difficiles de l’étude de la transmission du signal dans les systèmes nerveux central et périphérique. Les ions calcium jouent un rôle important dans le déclenchement de la libération de neurotransmetteurs, la plasticité synaptique et la modulation de l’activité de diverses protéines intracellulaires 1,2,3,4,5. L’étude de la signalisation du calcium est également importante pour trouver des moyens de traiter les maladies neurodégénératives⁶. Pour mesurer les changements dans les niveaux de calcium, des colorants fluorescents sensibles au calcium sont couramment utilisés, et les changements dans leur niveau de fluorescence sont analysés ^7,8,9.

Le chargement des colorants calciques dans les cellules peut être réalisé de différentes manières. Principalement, les colorants perméables aux cellules sont utilisés^10,11. Cependant, dans un tel cas, il est non seulement difficile de contrôler la concentration d’un colorant à l’intérieur de la cellule, mais il est également difficile de sélectionner les cellules cibles pour le chargement. Cette méthode n’est pas applicable à l’étude des terminaisons nerveuses périphériques puisque le colorant pénètre dans les cellules postsynaptiques. Au lieu de cela, les colorants imperméables cellulaires conviennent mieux à de telles préparations. Dans ce cas, les colorants sont délivrés aux cellules par micro-injection ou par une pipette patch^12,13,14. Il existe également une méthode de chargement à travers un moignon nerveux. Cette dernière méthode est la plus appropriée pour les préparations de jonction neuromusculaire 15,16,17,18,19,20. Il permet d’effectuer des colorations uniquement pour les cellules d’intérêt. Bien que cette méthode ne fournisse pas une évaluation précise de la concentration du colorant dans la cellule cible, la concentration peut être estimée approximativement en comparant le niveau de fluorescence des cellules au repos dans des solutions avec une concentration connue de calcium²¹. Dans cette étude, une modification de cette méthode appliquée aux synapses des mammifères est présentée.

L’entrée du calcium pendant la phase dépolarisante du potentiel d’action est un processus rapide, en particulier dans la jonction neuromusculaire; Par conséquent, pour son enregistrement, un équipement approprié est nécessaire¹. Une étude récente utilisant un colorant fluorescent sensible à la tension a démontré que la durée du potentiel d’action dans la synapse périphérique d’une souris est d’environ 300 μs²². Le calcium transitoire, évalué à l’aide de colorants sensibles au calcium dans les synapses périphériques de la grenouille, a une durée plus longue: le temps de montée est d’environ 2-6 ms et le temps de désintégration est d’environ 30-90 ms, selon le colorant calcique utilisé^23,24. Pour mesurer des processus rapides à l’aide de colorants fluorescents, des caméras CCD ou CMOS sont généralement utilisées, avec des matrices CCD rapides et sensibles. Cependant, ces caméras présentent l’inconvénient d’une faible résolution, limitée par la taille des éléments sensibles de la matrice^25,26,27,28. Les caméras les plus rapides avec une sensibilité suffisante pour enregistrer à la fois les potentiels d’action et les transitoires de calcium en réponse à la stimulation à basse fréquence des cellules ont une fréquence de balayage de 2 000 Hz et une matrice d’une dimension de 80 x 80²⁹. Pour obtenir des signaux avec une résolution spatiale plus élevée, la microscopie confocale est utilisée, surtout s’il est nécessaire d’évaluer certains changements volumétriques dans le signal^30,31,32. Mais il faut garder à l’esprit que la microscopie confocale a une vitesse de balayage élevée en mode balayage linéaire, mais il existe encore des limitations importantes à la vitesse d’enregistrement des processus rapides lors de la construction d’une image spatiale³³. Il existe des microscopes confocaux basés sur des disques de Nipkow rotatifs (microscopie à balayage à fente) et des scanners multipoints, qui ont une vitesse de balayage plus élevée. En même temps, ils sont inférieurs aux microscopes confocaux classiques dans le filtrage d’images confocales (diaphonie de trous d’épingle pour les microscopes avec un disque de Nipkow)^32,34,35. L’imagerie confocale avec balayage par résonance peut également fournir une résolution spatio-temporelle élevée requise pour des mesures temporelles élevées³⁶. Toutefois, il faut tenir compte du fait que l’enregistrement de faibles réponses fluorescentes à une vitesse de balayage élevée lors de l’utilisation de scanners à résonance nécessite des détecteurs très sensibles tels que les détecteurs hybrides³⁶.

Cet article présente une méthode permettant d’augmenter la résolution temporelle des signaux enregistrés avec la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) tout en maintenant la résolution spatiale³⁷. La méthode actuelle est un développement ultérieur des méthodes décrites précédemment et transférées à la plate-forme LSCM^38,39,40. Cette approche ne nécessite pas de modifications du matériel du microscope et est basée sur l’application d’un algorithme pour enregistrer des signaux fluorescents évoqués périodiquement avec un décalage temporel par rapport au moment de la stimulation.