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생화학

Production acellulaire de protéoliposomes pour l’analyse fonctionnelle et le développement d’anticorps ciblant les protéines membranaires

Published: September 22, 2020
doi:
10.3791/61871
,
1Graduate School of Medicine,Ehime University, 2Proteo-Science Center,Ehime University

Summary

Ce protocole décrit une méthode efficace sans cellules pour la production de protéoliposomes de haute qualité par dialyse bicouche utilisant un système sans cellules de blé et des liposomes. Cette méthode fournit des moyens appropriés pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires, le criblage des cibles médicamenteuses et le développement d’anticorps.

Abstract

Les protéines membranaires jouent un rôle essentiel dans une variété de processus cellulaires et remplissent des fonctions vitales. Les protéines membranaires sont médicalement importantes dans la découverte de médicaments, car elles sont la cible de plus de la moitié de tous les médicaments. Un obstacle à la réalisation d’études biochimiques, biophysiques et structurelles des protéines membranaires ainsi que du développement d’anticorps a été la difficulté de produire de grandes quantités de protéines membranaires de haute qualité avec une conformation et une activité correctes. Nous décrivons ici une « méthode de dialyse bicouche » utilisant un système sans cellules germinales de blé, des liposomes et des tasses de dialyse pour synthétiser efficacement les protéines membranaires et préparer des protéoliposomes purifiés en peu de temps avec un taux de réussite élevé. Les protéines membranaires peuvent être produites autant que dans plusieurs milligrammes, telles que les RCPG, les canaux ioniques, les transporteurs et les tétraspanines. Cette méthode acellulaire contribue à réduire le temps, le coût et les efforts nécessaires à la préparation de protéoliposomes de haute qualité et fournit des moyens appropriés pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires, le criblage de cibles médicamenteuses et le développement d’anticorps.

Introduction

Les protéines membranaires sont l’une des cibles médicamenteuses les plus importantes dans le diagnostic et la thérapeutique. En effet, la moitié des petits médicaments composés ciblés sont des protéines membranaires, telles que les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et les canaux ioniques1. Au fil des ans, les chercheurs ont travaillé sur des études biochimiques, biophysiques et structurales des protéines membranaires afin d’élucider leur structure et leur fonction 2,3. Le développement d’anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines membranaires est également réalisé activement afin d’accélérer les études fonctionnelles et structurelles et de développer des applications thérapeutiques et diagnostiques 4,5,6,7,8,9. Toutes ces études nécessitent une grande quantité de protéines membranaires de haute qualité10. Par exemple, plusieurs milligrammes de protéines membranaires purifiées avec une conformation naturelle sont nécessaires pour le développement d’anticorps. Une quantité beaucoup plus importante de protéines membranaires hautement purifiées est nécessaire pour la cristallographie aux rayons X. Cependant, la production de masse de protéines membranaires reste un goulot d’étranglement dans la recherche sur les protéines membranaires11. Les protéines membranaires ont des structures compliquées avec une ou plusieurs hélices transmembranaires et jouent un rôle important dans l’homéostasie cellulaire. La surexpression hétérologue des protéines membranaires entraîne de multiples obstacles tels que l’agrégation des protéines membranaires qui s’accumulent à des concentrations locales élevées ou la perturbation des voies de signal cellulaire. Même si l’expression est réussie, les étapes ultérieures de la préparation de l’échantillon rencontrent également des difficultés. Par exemple, la préparation du protéoliposome nécessite des compétences de haut niveau et des expériences professionnelles en solubilisation, purification et stabilisation des protéines membranaires, et coûte beaucoup d’efforts et de temps12,13.

D’autre part, certaines technologies de pointe ont émergé au cours des dernières décennies pour produire des protéines sans l’utilisation de cellules vivantes 14,15,16,17,18. La technologie de synthèse des protéines acellulaires reconstitue la réaction de traduction dans un tube à essai. Comme il n’y a pas de limites que le système d’expression cellulaire a, les systèmes acellulaires ont le potentiel de synthétiser une variété de protéines qui sont difficiles à exprimer ou qui montrent une toxicité dans les cellules. L’extrait cellulaire purifié ou la machinerie translationnelle reconstituée est mélangé avec des ARNm modèles, des acides aminés et des sources d’énergie, et les protéines recombinantes sont synthétisées en peu de temps. En ce qui concerne la synthèse des protéines membranaires, certains types d’échafaudages composés de lipides ou d’amphiphiles, tels que les liposomes, les bicelles, les nanodisques ou les copolymères sont ajoutés à la réaction acellulaire 19,20,21,22,23,24. Les protéines membranaires synthétisées interagissent avec les échafaudages et peuvent être stabilisées dans l’eau. Les protéines membranaires synthétisées acellulaires sont largement utilisées dans les études fonctionnelles et la production d’anticorps 25,26,27,28,29,30,31.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode efficace de production de protéoliposomes sans cellules utilisant un système sans cellules de blé et des liposomes. Le système de synthèse protéique acellulaire du blé est un puissant système de traduction in vitro utilisant l’extrait de germe de blé 15,32,33. Le germe de blé contient une grande quantité de machinerie translationnelle et peu d’inhibiteurs de la traduction. La machinerie translationnelle du blé, un membre des eucaryotes, convient à la traduction des protéines eucaryotes, et son efficacité de traduction n’est guère affectée par l’utilisation du codon de l’ARNm modèle. En utilisant un système sans cellules de blé, nous avons synthétisé une variété de protéines, y compris les protéines kinases 34,35, l’ubiquitine ligases36, les facteurs de transcription37 et les protéines membranaires avec des taux de réussite élevés. Pour la production de protéines membranaires, nous ajoutons le liposome des vésicules lipidiques dans le mélange de traduction sous forme d’échafaudage19,38. Les domaines hydrophobes de la protéine membranaire interagissent avec la bicouche lipidique et sont spontanément intégrés aux liposomes. La centrifugation par gradient de densité est utilisée pour séparer strictement le protéoliposome des protéines endogènes du blé, même si une centrifugation commune du mélange réactionnel de translation est suffisante pour une simple purification du protéoliposome20. De nombreux types de protéines membranaires intégrales ont été synthétisés à l’aide d’un système sans cellules de blé et appliqués pour diverses recherches et développements 25,38,39,40,41,42,43,44. De plus, nous avons développé la « méthode de dialyse bicouche » pour la production à grande échelle45,46. Dans cette méthode, un dispositif de dialyse de type tasse est immergé dans le tampon d’alimentation du substrat, et deux couches de mélange de réaction de translation et de tampon d’alimentation de substrat sont formées dans la tasse, comme illustré à la figure 1. L’approvisionnement continu en substrats et l’élimination du sous-produit peuvent être effectués efficacement en haut et en bas du mélange réactionnel pendant une longue période, ce qui conduit à une excellente efficacité de traduction (Figure 2A et Figure 2B)45.

Protocol

1. Préparation du plasmide d’expression pEU REMARQUE : le plasmide d’expression pEU doit inclure le codon de départ, le cadre de lecture ouvert de la protéine membranaire cible et le codon stop dans le fragment (voir Figure 1). Ajouter une ou plusieurs séquences d’étiquettes de détection/purification à l’endroit approprié au besoin. La digestion enzymatique de restriction ou le clonage continu est applicable au sous-clonage. Nous décrivons ici un pr…

Representative Results

En utilisant ce protocole, des protéoliposomes partiellement purifiés peuvent être obtenus en peu de temps. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2A. Vingt-cinq RCPG de classe A, B et C ont été synthétisés avec succès en utilisant la méthode de dialyse bicouche (à petite échelle) et partiellement purifiés par centrifugation et lavage tampon. Bien que la quantité de protéines synthétisées varie selon le type de protéine, 50 à 400 μg de protéines memb…

Discussion

Le protocole présenté fournit une méthode de production de protéines membranaires à un taux de réussite élevé. Ce protocole est simple, hautement reproductible et facile à mettre à l’échelle. Il a également le potentiel de réduire le temps et le coût des expériences qui consomment une grande quantité de protéines membranaires. La méthode de dialyse bicouche améliore la productivité de 4 à 10 fois par rapport à la méthode bicouche ou à la méthode de dialyse (Figure 2B</stron…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) de l’AMED sous le numéro de subvention JP20am0101077. Ce travail a également été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

Materials

×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240
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Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).
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