Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana
Summary
Questo protocollo descrive un metodo efficiente privo di cellule per la produzione di proteoliosomi di alta qualità mediante metodo di dialisi a doppio strato utilizzando un sistema privo di cellule di grano e liposomi. Questo metodo fornisce mezzi adeguati per l’analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening dei bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.
Abstract
Le proteine di membrana svolgono ruoli essenziali in una varietà di processi cellulari e svolgono funzioni vitali. Le proteine di membrana sono importanti dal punto di vista medico nella scoperta di farmaci perché sono gli obiettivi di oltre la metà di tutti i farmaci. Un ostacolo alla conduzione di studi biochimici, biofisici e strutturali sulle proteine di membrana e sullo sviluppo di anticorpi è stata la difficoltà di produrre grandi quantità di proteine di membrana di alta qualità con corretta conformazione e attività. Qui descriviamo un “metodo di dialisi a doppio strato” che utilizza un sistema privo di cellule di germe di grano, liposomi e coppette di dialisi per sintetizzare efficacemente le proteine di membrana e preparare proteoliposomi purificati in breve tempo con un alto tasso di successo. Le proteine di membrana possono essere prodotte tanto quanto in diversi milligrammi, come GPCR, canali ionici, trasportatori e tetraspanine. Questo metodo privo di cellule contribuisce a ridurre i tempi, i costi e gli sforzi per la preparazione di proteoliposomi di alta qualità e fornisce mezzi adeguati per l’analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening di bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.
Introduction
Le proteine di membrana sono uno dei bersagli farmacologici più importanti nella diagnosi e nella terapia. Infatti, metà dei piccoli farmaci composti bersaglio sono proteine di membrana, come i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e i canali ionici1. Nel corso degli anni, i ricercatori hanno lavorato su studi biochimici, biofisici e strutturali delle proteine di membrana per chiarire la loro struttura e funzione 2,3. Anche lo sviluppo di anticorpi monoclonali contro le proteine di membrana viene eseguito attivamente al fine di accelerare gli studi funzionali e strutturali e sviluppare applicazioni terapeutiche e diagnostiche 4,5,6,7,8,9. Tutti questi studi richiedono una grande quantità di proteine di membrana di alta qualità10. Ad esempio, sono necessari diversi milligrammi di proteine di membrana purificate con conformazione naturale per lo sviluppo di anticorpi. Una quantità molto maggiore di proteine di membrana altamente purificate è necessaria per la cristallografia a raggi X. Tuttavia, la produzione di massa di proteine di membrana rimane un collo di bottiglia nella ricerca sulle proteine di membrana11. Le proteine di membrana hanno strutture complicate con una o più eliche transmembrana e svolgono un ruolo importante nell’omeostasi cellulare. La sovraespressione eterologa delle proteine di membrana porta a molteplici ostacoli come l’aggregazione di proteine di membrana che si accumulano ad alte concentrazioni locali o il disturbo delle vie del segnale cellulare. Anche se l’espressione ha successo, anche le fasi successive della preparazione del campione incontrano difficoltà. Ad esempio, la preparazione del proteoliposoma, richiede competenze di alto livello ed esperienze professionali nella solubilizzazione, purificazione e stabilizzazione delle proteine di membrana, e costa molto sforzo e tempo anche12,13.
D’altra parte, alcune tecnologie avanzate sono emerse negli ultimi decenni per produrre proteine senza l’uso di cellule viventi 14,15,16,17,18. La tecnologia di sintesi proteica priva di cellule ricostituisce la reazione di traduzione in una provetta. Poiché non ci sono limitazioni che il sistema di espressione cellulare ha, i sistemi privi di cellule hanno il potenziale per sintetizzare una varietà di proteine che sono difficili da esprimere o mostrano tossicità nelle cellule. L’estratto cellulare purificato o il macchinario traslazionale ricostituito viene mescolato con mRNA modello, amminoacidi e fonti di energia e le proteine ricombinanti vengono sintetizzate in breve tempo. Per quanto riguarda la sintesi proteica di membrana, alcuni tipi di scaffold composti da lipidi o anfifili, come liposomi, bicelle, nanodischi o copolimeri vengono aggiunti alla reazione cell-free 19,20,21,22,23,24. Le proteine di membrana sintetizzate interagiscono con gli scaffold e possono essere stabilizzate in acqua. Le proteine di membrana sintetizzate prive di cellule sono ampiamente utilizzate negli studi funzionali e nella produzione di anticorpi 25,26,27,28,29,30,31.
In questo protocollo, descriviamo un metodo efficiente di produzione di proteoliposomi senza cellule utilizzando il sistema privo di cellule di grano e liposomi. Il sistema di sintesi proteica senza cellule di grano è un potente sistema di traduzione in vitro che utilizza l’estratto del germe di grano 15,32,33. Il germe di grano contiene una grande quantità di macchinari traslazionali e pochi inibitori della traduzione. Il meccanismo traslazionale nel grano, un membro degli eucarioti, è adatto per tradurre le proteine eucariotiche e la sua efficienza di traduzione è difficilmente influenzata dall’uso del codone del modello mRNA. Utilizzando il sistema privo di cellule di grano, abbiamo sintetizzato una varietà di proteine tra cui protein chinasi 34,35, ubiquitina ligasi36, fattori di trascrizione37 e proteine di membrana con alti tassi di successo. Per la produzione di proteine di membrana, aggiungiamo liposomi di vescicole lipidiche nella miscela di traduzione come scaffold19,38. I domini idrofobici delle proteine di membrana interagiscono con il doppio strato lipidico e sono spontaneamente integrati con il liposoma. La centrifugazione a gradiente di densità viene utilizzata per separare rigorosamente il proteoliosoma dalle proteine endogene del grano, anche se una centrifugazione comune della miscela della reazione di traduzione è sufficiente per una semplice purificazione del proteoliposomia20. Molti tipi di proteine integrali di membrana sono stati sintetizzati utilizzando il sistema privo di cellule di grano e applicati per varie ricerche e sviluppi 25,38,39,40,41,42,43,44. Inoltre, abbiamo sviluppato il “metodo di dialisi a doppio strato” per la produzione su larga scala45,46. In questo metodo, il dispositivo di dialisi a coppa viene immerso nel tampone di alimentazione del substrato e nella tazza si formano due strati di miscela di reazione di traslazione e tampone di alimentazione del substrato, come mostrato nella Figura 1. La fornitura continua di substrati e la rimozione del sottoprodotto possono essere condotte in modo efficiente sia nella parte superiore che in quella inferiore della miscela di reazione per lungo tempo, il che porta a un’eccellente efficacia di traduzione (Figura 2A e Figura 2B)45.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato fornisce un metodo per produrre proteine di membrana ad un alto tasso di successo. Questo protocollo è semplice, altamente riproducibile e facile da scalare. Ha anche il potenziale per ridurre i tempi e i costi degli esperimenti che consumano una grande quantità di proteine di membrana. Il metodo di dialisi a doppio strato migliora la produttività di 4-10 volte rispetto al metodo a doppio strato o al metodo di dialisi (Figura 2B)45. In un c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) di AMED con il numero di sovvenzione JP20am0101077. Questo lavoro è stato anche parzialmente supportato dal JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.
Materials
| ×3 SDS-PAGE sample buffer | Containing 10% 2-mercaptoethanol | ||
| 5-20% gradient SDS-PAGE gel | ATTO | E-D520L | |
| 70% ethanol | Diluted ethanol by ultrapure water. | ||
| Agarose | Takara Bio | ||
| Ammonium acetate | Nakalai tesque | 02406-95 | As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C. |
| Ampicillin Sodium | Nakalai tesque | 02739-74 | |
| Asolectin Liposome, lyophilized | CellFree Sciences | CFS-PLE-ASL | A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes. |
| BSA standard | 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer | ||
| CBB gel stain | |||
| cDNA clone of interest | Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment | ||
| Chloroform | Nakalai tesque | 08402-84 | |
| Cooled incubator | Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider. | ||
| Creatine kinase | Roche Diagnostics | 04524977190 | |
| Dialysis cup (0.1 mL) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL |
| Dialysis cup (2 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88404 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL |
| DNA ladder marker | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | GeneRuler 1 kb DNA Ladder |
| DpnI | Thermo Fisher Scientific | FD1703 | FastDigest DpnI |
| E. coli strain JM109 | |||
| Electrophoresis chamber | ATTO | ||
| Ethanol (99.5%) | Nakalai tesque | 14713-95 | |
| Ethidium bromide | |||
| Evaporation flask, 100 mL | |||
| Gel imager | |||
| Gel scanner | We use document scanner and LED immuninator as a substitute. | ||
| LB broth | |||
| Lipids of interest | Avanti Polar Lipids | ||
| Micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| NTP mix | CellFree Sciences | CFS-TSC-NTP | Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each |
| Nuclease-free 25 mL tube | IWAKI | 362-025-MYP | |
| Nucrease-free plastic tubes | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| Nucrease-free tips | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| PBS buffer | |||
| PCR purification kit | MACHEREY-NAGEL | 740609 | NucleoSpin Gel and PCR Clean-up |
| pEU-E01-MCS vector | CellFree Sciences | CFS-11 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Plasmid prep Midi kit | MACHEREY-NAGEL | 740410 | NucleoBond Xtra Midi |
| Primer 1 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 2 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 3 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 4 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 5 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward |
| Primer 6 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse |
| Protein size marker | Bio-Rad | 1610394 | Precision Plus Protein Standard |
| Rotary evaporator | |||
| seamless cloning enzyme mixture | New England BioLabs | E2611L | Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable. |
| SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor | CellFree Sciences | CFS-TSC-ENZ | |
| Submarine Electrophoresis system | |||
| TAE buffer | |||
| Transcription Buffer LM | CellFree Sciences | CFS-TSC-5TB-LM | |
| Translation buffer | CellFree Sciences | CFS-SUB-SGC | SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water. |
| Ultrapure water | We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle. |
||
| Ultrasonic homogenizer | Branson | SONIFIER model 450D-Advanced | Ultrasonic cleaner can be used as a substitute. |
| UV transilluminator | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Wheat germ extract | CellFree Sciences | CFS-WGE-7240 | WEPRO7240 |
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