إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة خالية من الخلايا لإنتاج بروتيوليبوزوم عالي الجودة عن طريق طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة باستخدام نظام خال من خلايا القمح والليبوزومات. توفر هذه الطريقة وسيلة مناسبة للتحليل الوظيفي للبروتينات الغشائية ، وفحص أهداف الأدوية ، وتطوير الأجسام المضادة.
Abstract
تلعب البروتينات الغشائية أدوارا أساسية في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية وتؤدي وظائف حيوية. البروتينات الغشائية مهمة طبيا في اكتشاف الأدوية لأنها أهداف لأكثر من نصف جميع الأدوية. كانت إحدى العقبات التي تحول دون إجراء الدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية والهيكلية للبروتينات الغشائية وكذلك تطوير الأجسام المضادة هي صعوبة إنتاج كميات كبيرة من البروتين الغشائي عالي الجودة مع التشكل والنشاط الصحيحين. هنا نصف “طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة” باستخدام نظام خال من خلايا جنين القمح ، والجسيمات الشحمية ، وأكواب غسيل الكلى لتصنيع البروتينات الغشائية بكفاءة وإعداد البروتينات البروتينية المنقاة في وقت قصير بمعدل نجاح مرتفع. يمكن إنتاج البروتينات الغشائية بقدر ما تنتج في عدة ملليغرام ، مثل GPCRs ، والقنوات الأيونية ، والناقلات ، و tetraspanins. تساهم هذه الطريقة الخالية من الخلايا في تقليل الوقت والتكلفة والجهد لإعداد البروتينات عالية الجودة ، وتوفر وسائل مناسبة للتحليل الوظيفي للبروتينات الغشائية ، وفحص أهداف الأدوية ، وتطوير الأجسام المضادة.
Introduction
البروتينات الغشائية هي واحدة من أهم أهداف الأدوية في التشخيص والعلاجات. في الواقع ، نصف الأدوية المركبة الصغيرة المستهدفة هي بروتينات غشائية ، مثل المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) والقنوات الأيونية1. على مر السنين ، كان الباحثون يعملون على دراسات كيميائية حيوية وفيزيائية وهيكلية للبروتينات الغشائية لتوضيح هيكلها ووظيفتها 2,3. كما يتم تطوير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد البروتينات الغشائية بنشاط من أجل تسريع الدراسات الوظيفية والهيكلية وتطوير التطبيقات العلاجية والتشخيصية4،5،6،7،8،9. كل هذه الدراسات تتطلب كمية كبيرة من البروتينات الغشائية عالية الجودة10. على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى عدة ملليغرامات من بروتينات الغشاء المنقى ذات التشكل الطبيعي لتطوير الأجسام المضادة. هناك حاجة إلى كمية أكبر بكثير من البروتينات الغشائية عالية النقاء لعلم البلورات بالأشعة السينية. ومع ذلك ، لا يزال الإنتاج الضخم للبروتينات الغشائية يمثل عنق الزجاجة في أبحاث البروتين الغشائي11. تحتوي البروتينات الغشائية على تراكيب معقدة مع حلزونات عبر غشائية واحدة أو أكثر، وتلعب أدوارا مهمة في الاتزان الخلوي. يؤدي الإفراط في التعبير غير المتجانس للبروتينات الغشائية إلى عقبات متعددة مثل تجميع البروتينات الغشائية التي تتراكم بتركيزات محلية عالية أو اضطراب مسارات الإشارات الخلوية. حتى لو كان التعبير ناجحا ، فإن الخطوات اللاحقة لإعداد العينة تواجه صعوبة أيضا. على سبيل المثال ، يتطلب تحضير البروتيوليبوزوم مهارات عالية المستوى وخبرات مهنية في إذابة البروتينات الغشائية وتنقيتها وتثبيتها ، ويكلف الكثير من الجهد والوقت أيضا12,13.
من ناحية أخرى ، ظهرت بعض التقنيات المتقدمة في العقود الأخيرة لإنتاج البروتينات دون استخدام الخلايا الحية14،15،16،17،18. تعيد تقنية تخليق البروتين الخالي من الخلايا تكوين تفاعل الترجمة في أنبوب اختبار. نظرا لعدم وجود قيود على نظام التعبير الخلوي ، فإن الأنظمة الخالية من الخلايا لديها القدرة على تصنيع مجموعة متنوعة من البروتينات التي يصعب التعبير عنها أو إظهار سميتها في الخلايا. يتم خلط مستخلص الخلايا المنقى أو الآلات الانتقالية المعاد تشكيلها مع قالب mRNAs والأحماض الأمينية ومصادر الطاقة ، ويتم تصنيع البروتينات المؤتلفة في وقت قصير. فيما يتعلق بتخليق البروتين الغشائي ، تتم إضافة بعض أنواع السقالات المكونة من الدهون أو البرمائيات ، مثل الجسيمات الشحمية أو البيسيلات أو الأقراص النانوية أو البوليمرات المشتركة إلى التفاعل الخالي من الخلايا19،20،21،22،23،24. تتفاعل بروتينات الغشاء المركبة مع السقالات ويمكن تثبيتها في الماء. تستخدم بروتينات الغشاء المركبة الخالية من الخلايا على نطاق واسع في الدراسات الوظيفية وإنتاج الأجسام المضادة 25،26،27،28،29،30،31.
في هذا البروتوكول ، نصف طريقة فعالة خالية من الخلايا لإنتاج البروتيوليبوزوم باستخدام نظام خال من خلايا القمح والجسيمات الشحمية. نظام تخليق البروتين الخالي من خلايا القمح هو نظام ترجمة قوي في المختبر باستخدام مستخلص من جنين القمح15،32،33. تحتوي جنين القمح على كمية كبيرة من الآلات الانتقالية وعدد قليل من مثبطات الترجمة. الآلية الانتقالية في القمح ، وهي عضو في حقيقيات النوى ، مناسبة لترجمة البروتينات حقيقية النواة ، ولا تتأثر كفاءتها في الترجمة باستخدام الكودون للقالب mRNA. باستخدام نظام خال من خلايا القمح ، قمنا بتجميع مجموعة متنوعة من البروتينات بما في ذلك كينازات البروتين34،35 ، و ubiquitinligases 36 ، وعوامل النسخ37 ، والبروتينات الغشائية ذات معدلات النجاح العالية. لإنتاج البروتين الغشائي ، نضيف ليبوزوم حويصلة دهنية إلى خليط الترجمة مثل سقالة19,38. تتفاعل المجالات الكارهة للماء للبروتين الغشائي مع طبقة ثنائية الدهون ويتم دمجها تلقائيا مع الجسيمات الشحمية. يستخدم الطرد المركزي المتدرج الكثافة لفصل البروتينات البروتينية بدقة عن بروتينات القمح الداخلية ، على الرغم من أن الطرد المركزي المشترك لخليط تفاعل الترجمة يكفي لتنقية بسيطة للبروتين20. تم تصنيع العديد من أنواع البروتينات الغشائية المتكاملة باستخدام نظام خال من خلايا القمح وتطبيقها على مختلف الأبحاث والتطورات25،38،39،40،41،42،43،44. علاوة على ذلك ، قمنا بتطوير “طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة” للإنتاج على نطاق واسع45،46. في هذه الطريقة ، يتم غمر جهاز غسيل الكلى من نوع الكوب في مخزن تغذية الركيزة ، ويتم تشكيل طبقتين من خليط تفاعل الترجمة ومخزن تغذية الركيزة في الكوب كما هو موضح في الشكل 1. يمكن إجراء الإمداد المستمر للركائز وإزالة المنتج الثانوي بكفاءة في كل من الجزء العلوي والسفلي من خليط التفاعل لفترة طويلة ، مما يؤدي إلى فعالية ترجمة ممتازة (الشكل 2A والشكل 2B)45.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول المقدم طريقة لإنتاج بروتينات الغشاء بمعدل نجاح مرتفع. هذا البروتوكول بسيط وقابل للتكرار بدرجة كبيرة وسهل التوسع. كما أن لديها القدرة على تقليل وقت وتكلفة التجارب التي تستهلك كمية كبيرة من البروتينات الغشائية. تعمل طريقة غسيل الكلى ثنائية الطبقة على تحسين الإنتاجية بمقدا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل مشروع المنصة لدعم اكتشاف الأدوية وأبحاث علوم الحياة (أساس دعم اكتشاف الأدوية المبتكرة وأبحاث علوم الحياة (BINDS)) من AMED تحت رقم المنحة JP20am0101077. كما تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 20K05709.
Materials
| ×3 SDS-PAGE sample buffer | Containing 10% 2-mercaptoethanol | ||
| 5-20% gradient SDS-PAGE gel | ATTO | E-D520L | |
| 70% ethanol | Diluted ethanol by ultrapure water. | ||
| Agarose | Takara Bio | ||
| Ammonium acetate | Nakalai tesque | 02406-95 | As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C. |
| Ampicillin Sodium | Nakalai tesque | 02739-74 | |
| Asolectin Liposome, lyophilized | CellFree Sciences | CFS-PLE-ASL | A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes. |
| BSA standard | 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer | ||
| CBB gel stain | |||
| cDNA clone of interest | Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment | ||
| Chloroform | Nakalai tesque | 08402-84 | |
| Cooled incubator | Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider. | ||
| Creatine kinase | Roche Diagnostics | 04524977190 | |
| Dialysis cup (0.1 mL) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL |
| Dialysis cup (2 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88404 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL |
| DNA ladder marker | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | GeneRuler 1 kb DNA Ladder |
| DpnI | Thermo Fisher Scientific | FD1703 | FastDigest DpnI |
| E. coli strain JM109 | |||
| Electrophoresis chamber | ATTO | ||
| Ethanol (99.5%) | Nakalai tesque | 14713-95 | |
| Ethidium bromide | |||
| Evaporation flask, 100 mL | |||
| Gel imager | |||
| Gel scanner | We use document scanner and LED immuninator as a substitute. | ||
| LB broth | |||
| Lipids of interest | Avanti Polar Lipids | ||
| Micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| NTP mix | CellFree Sciences | CFS-TSC-NTP | Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each |
| Nuclease-free 25 mL tube | IWAKI | 362-025-MYP | |
| Nucrease-free plastic tubes | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| Nucrease-free tips | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| PBS buffer | |||
| PCR purification kit | MACHEREY-NAGEL | 740609 | NucleoSpin Gel and PCR Clean-up |
| pEU-E01-MCS vector | CellFree Sciences | CFS-11 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Plasmid prep Midi kit | MACHEREY-NAGEL | 740410 | NucleoBond Xtra Midi |
| Primer 1 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 2 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 3 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 4 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 5 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward |
| Primer 6 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse |
| Protein size marker | Bio-Rad | 1610394 | Precision Plus Protein Standard |
| Rotary evaporator | |||
| seamless cloning enzyme mixture | New England BioLabs | E2611L | Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable. |
| SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor | CellFree Sciences | CFS-TSC-ENZ | |
| Submarine Electrophoresis system | |||
| TAE buffer | |||
| Transcription Buffer LM | CellFree Sciences | CFS-TSC-5TB-LM | |
| Translation buffer | CellFree Sciences | CFS-SUB-SGC | SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water. |
| Ultrapure water | We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle. |
||
| Ultrasonic homogenizer | Branson | SONIFIER model 450D-Advanced | Ultrasonic cleaner can be used as a substitute. |
| UV transilluminator | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Wheat germ extract | CellFree Sciences | CFS-WGE-7240 | WEPRO7240 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
- Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
- Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
- Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
- Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
- Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
- Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
- Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
- Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
- Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
- Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
- Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
- Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
- Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
- Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
- Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
- Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
- Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
- Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
- Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
- Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
- Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
- Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
- Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
- Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
- Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
- Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
- Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
- Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
- Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
- Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
- David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
- Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
- Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
- Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
- Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
- Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
- Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).
