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생화학

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Published: September 22, 2020
doi:
10.3791/61871
,
1Graduate School of Medicine,Ehime University, 2Proteo-Science Center,Ehime University

Summary

Este protocolo descreve um método eficiente livre de células para a produção de proteolipossomo de alta qualidade pelo método de diálise de duas camadas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. Este método fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Abstract

As proteínas de membrana desempenham papéis essenciais em uma variedade de processos celulares e desempenham funções vitais. As proteínas de membrana são clinicamente importantes na descoberta de medicamentos porque são os alvos de mais da metade de todos os medicamentos. Um obstáculo para a realização de estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana, bem como o desenvolvimento de anticorpos, tem sido a dificuldade em produzir grandes quantidades de proteína de membrana de alta qualidade com conformação e atividade corretas. Aqui descrevemos um “método de diálise de bicamadas” usando um sistema livre de células germinativas de trigo, lipossomas e copos de diálise para sintetizar eficientemente proteínas de membrana e preparar proteolipossomos purificados em um curto espaço de tempo com uma alta taxa de sucesso. As proteínas de membrana podem ser produzidas tanto quanto em vários miligramas, como GPCRs, canais iônicos, transportadores e tetraspaninas. Este método livre de células contribui para reduzir o tempo, o custo e o esforço para a preparação de proteolipossomas de alta qualidade e fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Introduction

As proteínas de membrana são um dos alvos mais importantes da droga no diagnóstico e terapêutica. De fato, metade dos pequenos alvos de drogas compostas são proteínas de membrana, como receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e canais iônicos1. Ao longo dos anos, pesquisadores vêm trabalhando em estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana para elucidar sua estrutura e função 2,3. O desenvolvimento de anticorpos monoclonais contra proteínas de membrana também é realizado ativamente, a fim de acelerar estudos funcionais e estruturais e desenvolver aplicações terapêuticas e diagnósticas 4,5,6,7,8,9. Todos esses estudos requerem uma grande quantidade de proteínas de membrana de alta qualidade10. Por exemplo, vários miligramas de proteínas de membrana purificadas com conformação natural são necessários para o desenvolvimento de anticorpos. Uma quantidade muito maior de proteínas de membrana altamente purificadas é necessária para a cristalografia de raios-X. No entanto, a produção em massa de proteínas de membrana continua sendo um gargalo na pesquisa de proteínas de membrana11. As proteínas de membrana têm estruturas complicadas com uma ou mais hélices transmembranares e desempenham papéis importantes na homeostase celular. A superexpressão heteróloga de proteínas de membrana leva a múltiplos obstáculos, como a agregação de proteínas de membrana que se acumulam em altas concentrações locais ou a perturbação das vias de sinal celular. Mesmo que a expressão seja bem-sucedida, as etapas subsequentes de preparação da amostra também enfrentam dificuldades. Por exemplo, o preparo do proteolipossomo requer habilidades de alto nível e experiências profissionais em solubilização, purificação e estabilização de proteínas de membrana, e também custa muito esforço e tempo12,13.

Por outro lado, algumas tecnologias avançadas têm surgido nas últimas décadas para produzir proteínas sem o uso de células vivas 14,15,16,17,18. A tecnologia de síntese proteica livre de células reconstitui a reação de tradução em um tubo de ensaio. Como não há limitações que o sistema de expressão celular tenha, os sistemas livres de células têm potencial para sintetizar uma variedade de proteínas que são difíceis de expressar ou mostrar toxicidade nas células. O extrato de células purificadas ou a maquinaria translacional reconstituída é misturado com mRNAs modelo, aminoácidos e fontes de energia, e as proteínas recombinantes são sintetizadas em um curto espaço de tempo. Em relação à síntese proteica da membrana, alguns tipos de andaimes compostos por lipídios ou anfífilos, como lipossomas, biceles, nanodiscos ou copolímeros são adicionados à reação livre de células 19,20,21,22,23,24. As proteínas de membrana sintetizadas interagem com os andaimes e podem ser estabilizadas em água. Proteínas de membrana sintetizadas livres de células são amplamente utilizadas em estudos funcionais e na produção de anticorpos 25,26,27,28,29,30,31.

Neste protocolo, descrevemos um método eficiente livre de células de produção de proteolipossomas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. O sistema de síntese proteica livre de células de trigo é um poderoso sistema de tradução in vitro que utiliza extrato de gérmen de trigo 15,32,33. O gérmen de trigo contém uma grande quantidade de máquinas de tradução e poucos inibidores de tradução. O maquinário translacional no trigo, um membro dos eucariotos, é adequado para traduzir proteínas eucarióticas, e sua eficiência de tradução dificilmente é afetada pelo uso do códon do mRNA modelo. Usando o sistema livre de células de trigo, sintetizamos uma variedade de proteínas, incluindo proteínas quinases 34,35, ubiquitina ligases36, fatores de transcrição37 e proteínas de membrana com altas taxas de sucesso. Para a produção de proteína de membrana, adicionamos lipossomo lipídico vesícula na mistura de tradução como andaime19,38. Os domínios hidrofóbicos da proteína de membrana interagem com a bicamada lipídica e são espontaneamente integrados com o lipossoma. A centrifugação por gradiente de densidade é usada para separar estritamente o proteolifossomo das proteínas endógenas do trigo, embora uma centrifugação comum da mistura de reação de translação seja suficiente para uma simples purificação do proteolipossomo20. Muitos tipos de proteínas de membrana integral têm sido sintetizados utilizando o sistema livre de células de trigo e aplicados para várias pesquisas e desenvolvimentos 25,38,39,40,41,42,43,44. Além disso, desenvolvemos o “método bicamada-diálise” para produção em larga escala45,46. Neste método, o dispositivo de diálise do tipo copo é imerso no tampão de alimentação do substrato, e duas camadas de mistura de reação de translação e tampão de alimentação do substrato são formadas no copo, como mostra a Figura 1. O fornecimento contínuo de substratos e a remoção do subproduto podem ser conduzidos de forma eficiente tanto na parte superior quanto na parte inferior da mistura reacional por um longo tempo, o que leva a uma excelente eficácia de tradução (Figura 2A e Figura 2B)45.

Protocol

1. Preparação do plasmídeo de expressão pEU NOTA: o plasmídeo de expressão pEU deve incluir o códon inicial, o quadro de leitura aberto da proteína de membrana alvo e o códon de paragem no fragmento (ver Figura 1). Adicione sequência(s) de etiqueta(s) de detecção/purificação na posição apropriada, quando necessário. A digestão enzimática de restrição ou a clonagem sem costura são aplicáveis à subclonagem. Aqui descrevemos um protocolo usando …

Representative Results

Usando este protocolo, proteolipossomas parcialmente purificados podem ser obtidos em um curto espaço de tempo. Os resultados representativos são apresentados na Figura 2A. Vinte e cinco GPCRs de Classe A, B e C foram sintetizados com sucesso usando o método de diálise de bicamádas (pequena escala) e parcialmente purificados por centrifugação e lavagem tampão. Embora a quantidade de proteínas sintetizadas varie de acordo com o tipo de proteína, 50 a 400 μg de proteínas de membran…

Discussion

O protocolo apresentado fornece um método de produção de proteínas de membrana a uma alta taxa de sucesso. Este protocolo é simples, altamente reprodutível e fácil de ampliar. Também tem o potencial de reduzir o tempo e o custo de experimentos que consomem uma grande quantidade de proteínas de membrana. O método bicamada-diálise melhora a produtividade em 4–10 vezes em comparação com o método bicamada ou método de diálise (Figura 2B)45. Em um caso ex…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto de Plataforma para Apoio à Descoberta de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (Base para Apoiar a Descoberta Inovadora de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (BINDS)) da AMED sob o Número de Concessão JP20am0101077. Este trabalho também foi parcialmente apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

Materials

×3 SDS-PAGE sample buffer Containing 10% 2-mercaptoethanol
5-20% gradient SDS-PAGE gel ATTO E-D520L
70% ethanol Diluted ethanol by ultrapure water.
Agarose Takara Bio
Ammonium acetate Nakalai tesque 02406-95 As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C.
Ampicillin Sodium Nakalai tesque 02739-74
Asolectin Liposome, lyophilized CellFree Sciences CFS-PLE-ASL A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.
BSA standard 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer
CBB gel stain
cDNA clone of interest Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment
Chloroform Nakalai tesque 08402-84
Cooled incubator Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider.
Creatine kinase Roche Diagnostics 04524977190
Dialysis cup (0.1 mL) Thermo Fisher Scientific 69570 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL
Dialysis cup (2 mL) Thermo Fisher Scientific 88404 Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL
DNA ladder marker Thermo Fisher Scientific SM0311 GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnI Thermo Fisher Scientific FD1703 FastDigest DpnI
E. coli strain JM109
Electrophoresis chamber ATTO
Ethanol (99.5%) Nakalai tesque 14713-95
Ethidium bromide
Evaporation flask, 100 mL
Gel imager
Gel scanner We use document scanner and LED immuninator as a substitute.
LB broth
Lipids of interest Avanti Polar Lipids
Micro centrifuge TOMY MX-307
NTP mix CellFree Sciences CFS-TSC-NTP Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each
Nuclease-free 25 mL tube IWAKI 362-025-MYP
Nucrease-free plastic tubes Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
Nucrease-free tips Watson bio labs Do not autoclave. Use them separately from other experiments.
PBS buffer
PCR purification kit MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up
pEU-E01-MCS vector CellFree Sciences CFS-11
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Plasmid prep Midi kit MACHEREY-NAGEL 740410 NucleoBond Xtra Midi
Primer 1 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 2 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’
Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence.
Primer 3 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 4 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.
Primer 5 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’
Sequencing primer, forward
Primer 6 Thermo Fisher Scientific Custom oligo synthesis 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’
Sequencing primer, reverse
Protein size marker Bio-Rad 1610394 Precision Plus Protein Standard
Rotary evaporator
seamless cloning enzyme mixture New England BioLabs E2611L Gibson Assembly Master Mix
Other seamless cloning reagents are also avairable.
SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor CellFree Sciences CFS-TSC-ENZ
Submarine Electrophoresis system
TAE buffer
Transcription Buffer LM CellFree Sciences CFS-TSC-5TB-LM
Translation buffer CellFree Sciences CFS-SUB-SGC SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4).
Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.
Ultrapure water We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave.
We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system.
Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.
Ultrasonic homogenizer Branson SONIFIER model 450D-Advanced Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.
UV transilluminator
Vacuum desiccator
Wheat germ extract CellFree Sciences CFS-WGE-7240 WEPRO7240
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Zhou, W., Takeda, H. Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (163), e61871, doi:10.3791/61871 (2020).
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