ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ללא תאים לייצור פרוטאוליפוזום באיכות גבוהה בשיטת דו-שכבתית-דיאליזה באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. שיטה זו מספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.
Abstract
חלבוני ממברנה ממלאים תפקידים חיוניים במגוון תהליכים תאיים ומבצעים תפקידים חיוניים. חלבוני ממברנה חשובים מבחינה רפואית בגילוי תרופות מכיוון שהם המטרות של יותר ממחצית מכל התרופות. מכשול לביצוע מחקרים ביוכימיים, ביופיזיקליים ומבניים של חלבוני ממברנה, כמו גם פיתוח נוגדנים, היה הקושי לייצר כמויות גדולות של חלבון ממברנה באיכות גבוהה עם קונפורמציה ופעילות נכונה. כאן אנו מתארים “שיטת דיאליזה דו-שכבתית” המשתמשת במערכת נטולת תאי נבט חיטה, ליפוזומים וכוסות דיאליזה כדי לסנתז ביעילות חלבוני ממברנה ולהכין פרוטאוליפוזומים מטוהרים בזמן קצר עם אחוזי הצלחה גבוהים. חלבוני ממברנה יכולים להיות מיוצרים עד כמה מיליגרם, כגון GPCRs, תעלות יונים, טרנספורטרים וטטרספאנינים. שיטה נטולת תאים זו תורמת להפחתת הזמן, העלות והמאמץ להכנת פרוטאוליפוזומים באיכות גבוהה, ומספקת אמצעים מתאימים לניתוח פונקציונלי של חלבוני ממברנה, סינון מטרות תרופות ופיתוח נוגדנים.
Introduction
חלבוני ממברנה הם אחד מיעדי התרופות החשובים ביותר באבחון ובטיפול. ואכן, מחצית מהתרופות המורכבות הקטנות הן חלבוני ממברנה, כגון קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) ותעלות יונים1. במהלך השנים, חוקרים עבדו על מחקרים ביוכימיים, ביופיזיקליים ומבניים של חלבוני ממברנה כדי להבהיר את המבנה והתפקוד שלהם 2,3. פיתוח נוגדנים חד שבטיים כנגד חלבוני ממברנה מתבצע גם הוא באופן פעיל על מנת להאיץ מחקרים תפקודיים ומבניים ולפתח יישומים טיפוליים ואבחוניים 4,5,6,7,8,9. כל המחקרים הללו דורשים כמות גדולה של חלבוני ממברנהבאיכות גבוהה 10. לדוגמה, כמה מיליגרם של חלבוני ממברנה מטוהרים עם קונפורמציה טבעית נדרשים לפיתוח נוגדנים. כמות גדולה בהרבה של חלבוני ממברנה מטוהרים מאוד נדרשת לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. עם זאת, ייצור המוני של חלבוני ממברנה נותר צוואר בקבוק במחקר חלבוני ממברנה11. לחלבוני ממברנה יש מבנים מורכבים עם הליקיס טרנס-ממברנה אחד או יותר והם ממלאים תפקידים חשובים בהומאוסטזיס של התא. ביטוי יתר הטרולוגי של חלבוני ממברנה מוביל למכשולים מרובים כגון צבירה של חלבוני ממברנה המצטברים בריכוזים מקומיים גבוהים או הפרעה למסלולי האותות התאיים. גם אם ההבעה מוצלחת, גם הצעדים הבאים של הכנת המדגם נתקלים בקושי. לדוגמה, הכנת פרוטאוליפוזום, דורשת מיומנויות ברמה גבוהה וניסיון מקצועי בסולוביליזציה, טיהור וייצוב של חלבוני ממברנה, ועולה הרבה מאמץ וזמן כמו גם12,13.
מצד שני, כמה טכנולוגיות מתקדמות התפתחו בעשורים האחרונים כדי לייצר חלבונים ללא שימוש בתאים חיים 14,15,16,17,18. טכנולוגיית סינתזת חלבונים ללא תאים יוצרת מחדש תגובת תרגום במבחנה. מאחר שאין מגבלות שיש למערכת הביטוי התאית, למערכות נטולות תאים יש פוטנציאל לסנתז מגוון חלבונים שקשה לבטא או להראות רעילות בתאים. תמצית תאים מטוהרים או מכונות תרגום משוחזרות מעורבבות עם mRNA של תבנית, חומצות אמינו ומקורות אנרגיה, וחלבונים רקומביננטיים מסונתזים תוך זמן קצר. לגבי סינתזת חלבון הממברנה, סוגים מסוימים של פיגומים המורכבים מליפידים או אמפיפילים, כגון ליפוזומים, דו-תאים, ננו-דיסקים או קופולימרים מתווספים לתגובה נטולת התאים 19,20,21,22,23,24. חלבוני ממברנה מסונתזים מתקשרים עם הפיגומים וניתן לייצבם במים. חלבוני ממברנה מסונתזים ללא תאים נמצאים בשימוש נרחב במחקרים פונקציונליים ובייצור נוגדנים 25,26,27,28,29,30,31.
בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה יעילה נטולת תאים לייצור פרוטאוליפוזומים באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה וליפוזומים. מערכת סינתזת חלבונים נטולת תאי חיטה היא מערכת תרגום חוץ גופית רבת עוצמה המשתמשת בתמצית מנבט חיטה 15,32,33. נבט חיטה מכיל כמות גדולה של מכונות תרגום ומעט מעכבי תרגום. המנגנון התרגומי בחיטה, חבר באאוקריוטים, מתאים לתרגום חלבונים אאוקריוטים, ויעילות התרגום שלו כמעט ואינה מושפעת משימוש קודון בתבנית mRNA. באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה, סינתזנו מגוון חלבונים, כולל חלבונים קינאזות 34,35, יוביקוויטין ליגאזות 36, גורמי שעתוק 37 וחלבוני ממברנה עם אחוזי הצלחה גבוהים. לייצור חלבון ממברנה, אנו מוסיפים ליפוזום שלפוחית שומנים לתערובת התרגום כפיגום19,38. תחומים הידרופוביים של חלבון ממברנה אינטראקציה עם bilayer שומנים והם משולבים באופן ספונטני עם ליפוזום. צנטריפוגה הדרגתית צפיפות משמשת להפרדת פרוטאוליפוזום מחלבוני חיטה אנדוגניים, למרות שצנטריפוגה נפוצה של תערובת תגובת התרגום מספיקה לטיהור פשוט של פרוטאוליפוזום20. סוגים רבים של חלבוני ממברנה אינטגרליים סונתזו באמצעות מערכת נטולת תאי חיטה ויושמו למחקרים ופיתוחים שונים 25,38,39,40,41,42,43,44. יתר על כן, פיתחנו את “שיטת דו-שכבתיות-דיאליזה” לייצור בקנה מידה גדולשל 45,46. בשיטה זו, מכשיר דיאליזה מסוג שקוע במאגר הזנת המצע, ושתי שכבות של תערובת תגובת תרגום ומאגר הזנת מצע נוצרות בכוס כפי שמוצג באיור 1. אספקה רציפה של מצעים והסרה של תוצר הלוואי יכולים להתבצע ביעילות הן בחלק העליון והן בחלק התחתון של תערובת התגובה במשך זמן רב, מה שמוביל ליעילות תרגום מצוינת (איור 2A ואיור 2B)45.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מספק שיטה לייצור חלבוני ממברנה בשיעור הצלחה גבוה. פרוטוקול זה הוא פשוט, ניתן לשחזור מאוד וקל להרחבה. יש לו גם פוטנציאל להפחית את הזמן והעלות של ניסויים הצורכים כמות גדולה של חלבוני ממברנה. שיטת דו-שכבת-דיאליזה משפרת את הפרודוקטיביות פי 4-10 בהשוואה לשיטת דו-שכבתי או שיטת דיאל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי פרויקט פלטפורמה לתמיכה בגילוי תרופות ומחקר במדעי החיים (בסיס לתמיכה בגילוי תרופות חדשניות ומחקר במדעי החיים (BINDS)) מ- AMED תחת מענק מספר JP20am0101077. עבודה זו נתמכה חלקית גם על ידי JSPS KAKENHI מענק מספר 20K05709.
Materials
| ×3 SDS-PAGE sample buffer | Containing 10% 2-mercaptoethanol | ||
| 5-20% gradient SDS-PAGE gel | ATTO | E-D520L | |
| 70% ethanol | Diluted ethanol by ultrapure water. | ||
| Agarose | Takara Bio | ||
| Ammonium acetate | Nakalai tesque | 02406-95 | As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30°C. |
| Ampicillin Sodium | Nakalai tesque | 02739-74 | |
| Asolectin Liposome, lyophilized | CellFree Sciences | CFS-PLE-ASL | A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes. |
| BSA standard | 1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µL ×1 SDS-PAGE sample buffer | ||
| CBB gel stain | |||
| cDNA clone of interest | Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment | ||
| Chloroform | Nakalai tesque | 08402-84 | |
| Cooled incubator | Temperature ranging from 0 to 40 °C or wider. | ||
| Creatine kinase | Roche Diagnostics | 04524977190 | |
| Dialysis cup (0.1 mL) | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL |
| Dialysis cup (2 mL) | Thermo Fisher Scientific | 88404 | Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL |
| DNA ladder marker | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | GeneRuler 1 kb DNA Ladder |
| DpnI | Thermo Fisher Scientific | FD1703 | FastDigest DpnI |
| E. coli strain JM109 | |||
| Electrophoresis chamber | ATTO | ||
| Ethanol (99.5%) | Nakalai tesque | 14713-95 | |
| Ethidium bromide | |||
| Evaporation flask, 100 mL | |||
| Gel imager | |||
| Gel scanner | We use document scanner and LED immuninator as a substitute. | ||
| LB broth | |||
| Lipids of interest | Avanti Polar Lipids | ||
| Micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| NTP mix | CellFree Sciences | CFS-TSC-NTP | Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each |
| Nuclease-free 25 mL tube | IWAKI | 362-025-MYP | |
| Nucrease-free plastic tubes | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| Nucrease-free tips | Watson bio labs | Do not autoclave. Use them separately from other experiments. | |
| PBS buffer | |||
| PCR purification kit | MACHEREY-NAGEL | 740609 | NucleoSpin Gel and PCR Clean-up |
| pEU-E01-MCS vector | CellFree Sciences | CFS-11 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Plasmid prep Midi kit | MACHEREY-NAGEL | 740410 | NucleoBond Xtra Midi |
| Primer 1 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 2 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3’ Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn…. (20-30 bp) shows gene specific sequence. |
| Primer 3 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3' Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 4 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3' Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning. |
| Primer 5 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3’ Sequencing primer, forward |
| Primer 6 | Thermo Fisher Scientific | Custom oligo synthesis | 5’- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3’ Sequencing primer, reverse |
| Protein size marker | Bio-Rad | 1610394 | Precision Plus Protein Standard |
| Rotary evaporator | |||
| seamless cloning enzyme mixture | New England BioLabs | E2611L | Gibson Assembly Master Mix Other seamless cloning reagents are also avairable. |
| SP6 RNA Polymerase & RNase Inhibitor | CellFree Sciences | CFS-TSC-ENZ | |
| Submarine Electrophoresis system | |||
| TAE buffer | |||
| Transcription Buffer LM | CellFree Sciences | CFS-TSC-5TB-LM | |
| Translation buffer | CellFree Sciences | CFS-SUB-SGC | SUB-AMIX SGC (×40) stock solution (S1, S2, S3, S4). Prepare ×1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water. |
| Ultrapure water | We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle. |
||
| Ultrasonic homogenizer | Branson | SONIFIER model 450D-Advanced | Ultrasonic cleaner can be used as a substitute. |
| UV transilluminator | |||
| Vacuum desiccator | |||
| Wheat germ extract | CellFree Sciences | CFS-WGE-7240 | WEPRO7240 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 63, 18-25 (2020).
- Congreve, M., de Graaf, C., Swain, N. A., Tate, C. G. Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell. 181 (1), 81-91 (2020).
- Wilkinson, T. C. I. Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 831-837 (2016).
- Hino, T., Iwata, S., Murata, T. Generation of functional antibodies for mammalian membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 563-568 (2013).
- Webb, D. R., Handel, T. M., Kretz-Rommel, A., Stevens, R. C. Opportunities for functional selectivity in GPCR antibodies. Biochemical Pharmacology. 85 (2), 147-152 (2013).
- Douthwaite, J. A., Finch, D. K., Mustelin, T., Wilkinson, T. C. I. Development of therapeutic antibodies to G-protein coupled receptors and ion channels: Opportunities, challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacology and Therapeutics. 169, 113-123 (2016).
- Hashimoto, Y., Yagi, K., Kondoh, M. Current progress in a second-generation claudin binder, anti-claudin antibody, for clinical applications. Drug Discovery Today. 21 (10), 1711-1718 (2016).
- Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. mAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
- Errey, J. C., Fiez-Vandal, C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expression and Purification. 169, 105569 (2020).
- Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
- Wiseman, D. N., et al. Expression and purification of recombinant G protein-coupled receptors: a review. Protein Expression and Purification. 167, 105524 (2020).
- Jeffery, C. J. Expression, Solubilization, and Purification of Bacterial Membrane Proteins. Current Protocols in Protein Science. 83 (1), 1-15 (2016).
- Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242 (4882), 1162-1164 (1988).
- Takai, K., Sawasaki, T., Endo, Y. Practical cell-free protein synthesis system using purified wheat embryos. Nature Protocols. 5 (2), 227-238 (2010).
- Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
- Shimizu, Y., Kuruma, Y., Ying, B. W., Umekage, S., Ueda, T. Cell-free translation systems for protein engineering. The FEBS Journal. 273 (18), 4133-4140 (2006).
- Klammt, C., et al. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. The FEBS Journal. 273 (18), 4141-4153 (2006).
- Nozawa, A., et al. A cell-free translation and proteoliposome reconstitution system for functional analysis of plant solute transporters. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1815-1820 (2007).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35-45 (2011).
- Henrich, E., Hein, C., Dotsch, V., Bernhard, F. Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).
- Henrich, E., Peetz, O., et al. Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology. eLife. 6, 243 (2017).
- Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins. Frontiers in Pharmacology. 10, 744 (2019).
- Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).
- Sackin, H., Nanazashvili, M., Makino, S. I. Direct injection of cell-free Kir1.1 protein into Xenopus oocytes replicates single-channel currents derived from Kir1.1 mRNA. Channels. 9 (4), 196-199 (2015).
- Zemella, A., Richter, T., Thoring, L., Kubick, S. A combined cell-free protein synthesis and fluorescence-based approach to investigate GPCR binding properties. Methods in Molecular Biology. 1947 (10), 57-77 (2019).
- Vaish, A., Guo, S., Murray, R. M., Grandsard, P. J., Chen, Q. On-chip membrane protein cell-free expression enables development of a direct binding assay: A curious case of potassium channel KcsA-Kv1.3. Analytical Biochemistry. 556, 70-77 (2018).
- Suzuki, Y., et al. Functional G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) synthesis: the pharmacological analysis of Human Histamine H1 Receptor (HRH1) synthesized by a wheat germ cell-free protein synthesis system combined with asolectin glycerosomes. Frontiers in Pharmacology. 9, 38 (2018).
- Cortes, S., Barette, C., Beroud, R., De Waard, M., Schaack, B. Functional characterization of cell-free expressed Kv1.3 channel using a voltage-sensitive fluorescent dye. Protein Expression and Purification. 145, 94-99 (2018).
- Woznicka-Misaila, A., Juillan-Binard, C., Baud, D., Pebay-Peyroula, E., Ravaud, S. Cell-free production, purification and characterization of human mitochondrial ADP/ATP carriers. Protein Expression and Purification. 144, 46-54 (2018).
- Hashimoto, Y., et al. Engineered membrane protein antigens successfully induce antibodies against extracellular regions of claudin-5. Scientific Reports. 8 (1), 8383 (2018).
- Sawasaki, T., et al. A bilayer cell-free protein synthesis system for high-throughput screening of gene products. FEBS Letters. 514 (1), 102-105 (2002).
- Goshima, N., et al. Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nature Methods. 5 (12), 1011-1017 (2008).
- Nemoto, K., Takemori, N., Seki, M., Shinozaki, K., Sawasaki, T. Members of the plant CRK superfamily are capable of trans- and autophosphorylation of tyrosine residues. The Journal of Biological Chemistry. 290 (27), 16665-16677 (2015).
- Takeda, H., et al. Comparative analysis of human src-family kinase substrate specificity in vitro. Journal of Proteome Research. 9 (11), 5982-5993 (2010).
- Takahashi, H., et al. Establishment of a wheat cell-free synthesized protein array containing 250 human and mouse E3 ubiquitin ligases to identify novel interaction between E3 ligases and substrate proteins. PLoS One. 11 (6), 0156718 (2016).
- Nozawa, A., et al. Construction of a protein library of Arabidopsis transcription factors using a wheat cell-free protein production system and its application for DNA binding analysis. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (7), 1661-1664 (2009).
- Goren, M. A., Nozawa, A., Makino, S. I., Wrobel, R. L., Fox, B. G. Cell-free translation of integral membrane proteins into unilamelar liposomes. Methods in Enzymology. 463, 647-673 (2009).
- Nozawa, A., et al. Production and partial purification of membrane proteins using a liposome-supplemented wheat cell-free translation system. BMC Biotechnology. 11 (1), 35 (2011).
- Renauld, S., et al. Functional reconstitution of cell-free synthesized purified Kv channels. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1859 (12), 2373-2380 (2017).
- Liu, S., et al. Efficiency and Safety of CRAC Inhibitors in Human Rheumatoid Arthritis Xenograft Models. Journal of Immunology. 199 (5), 1584-1595 (2017).
- Jarecki, B. W., Makino, S. I., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into xenopus oocytes. Scientific Reports. 3, 1-7 (2013).
- David, G., et al. Phosphorylation and alternative translation on wheat germ cell-free protein synthesis of the DHBV large envelope protein. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 138 (2019).
- Jirasko, V., et al. Proton-detected solid-state NMR of the cell-free synthesized α-helical transmembrane protein NS4B from hepatitis C virus. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 21 (10), 1453-1460 (2020).
- Takeda, H., et al. Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Scientific Reports. 5, 11333 (2015).
- Zhou, W., Takeda, H. Production of immunizing antigen proteoliposome using cell-free protein synthesis system. Methods in Molecular Biology. 1868, 49-67 (2018).
- Hutchings, C. J., Koglin, M., Marshall, F. H. Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. mAbs. 2 (6), 594-606 (2010).
- Raetz, C. R. H., et al. Discovery of new biosynthetic pathways: the lipid A story. Journal of Lipid Research. 50, 103-108 (2009).
- Baldridge, J. R., Crane, R. T. Monophosphoryl lipid A (MPL) formulations for the next generation of vaccines. Methods. 19 (1), 103-107 (1999).
