Summary

Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

Published: July 02, 2020
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Summary

Este es un protocolo para la preparación aguda de la rebanada de hipocampo adulto y envejecido del ratón que aprovecha la perfusión transcardial y el corte de rodajas con NMDG-aCSF helado para reducir el daño hipoxico al tejido. Las rebanadas resultantes se mantienen saludables durante muchas horas y son adecuadas para grabaciones de parches y de campo a largo plazo.

Abstract

Las rebanadas agudas del hipocampo han permitido a generaciones de neurocientíficos explorar las propiedades sinápticas, neuronales y de circuito en detalle y con alta fidelidad. La exploración de los mecanismos LTP y LTD, el cálculo dendrítico de una sola neurona y los cambios dependientes de la experiencia en los circuitos, no habrían sido posibles sin esta preparación clásica. Sin embargo, con algunas excepciones, la mayoría de las investigaciones básicas utilizando rodajas agudas de hipocampo se han realizado utilizando rebanadas de roedores de edades relativamente jóvenes, P20-P40, a pesar de que los mecanismos de excitabilidad sináptica e intrínseca tienen una larga cola de desarrollo que supera el P60. El principal atractivo del uso de rebanadas de hipocampo joven es la preservación de la salud neuronal ayudada por una mayor tolerancia al daño hipoxico. Sin embargo, hay una necesidad de entender la función neuronal en etapas más maduras de desarrollo, acentuado aún más por el desarrollo de varios modelos animales de enfermedades neurodegenerativas que requieren una preparación cerebral envejecida. Aquí describimos una modificación a una preparación aguda de la rebanada del hipocampo que entrega de forma fiable rebanadas saludables de hipocampos adultos y de ratón envejecido. Los pasos críticos del protocolo son la perfusión transcardial y el corte con NMDG-aSCF sin sodio helado. Juntos, estos pasos atenúan la caída inducida por hipoxia en ATP tras la decapitación, así como el edema citotóxico causado por los flujos pasivos de sodio. Demostramos cómo cortar rodajas transversales de hipocampo más corteza usando un microtoma vibratorio. Las rebanadas agudas del hipocampo obtenidas de esta manera son confiablemente saludables durante muchas horas de grabación, y son apropiadas tanto para grabaciones de campo como para grabaciones dirigidas de abrazaderas de parches, incluida la segmentación de neuronas con la etiqueta fluorescente.

Introduction

El advenimiento de las preparaciones agudas de la rebanada cerebral de los mamíferos facilitó experimentos a nivel celular y sináptico que antes sólo eran posibles en preparaciones de invertebrados como Aplysia1. El desarrollo de rebanadas agudas del hipocampo fue de particular importancia, ya que es una estructura responsable de la memoria de trabajo y la formación de contexto, y tiene un circuito trisináptico especializado que es amenable a la manipulación fisiológica fácil. Sin embargo, la gran mayoría de las rebanadas cerebrales agudas todavía se preparan a partir de ratones y ratas relativamente jóvenes, ya que es más fácil preservar las neuronas y circuitos sanos, y las rebanadas siguen siendo viables durante períodos más largos de tiempo2,,3,,4. Aquí, introducimos modificaciones en los protocolos de corte estándar que resultan en una mayor viabilidad de las rodajas agudas del hipocampo de ratones adultos y envejecidos.

El principal impedimento para la viabilidad ex vivo a largo plazo del parénquima cerebral de los mamíferos es el daño hipoxico inicial que ocurre rápidamente una vez que el flujo sanguíneo al cerebro deja de disminuir. La pérdida de oxígeno resulta en un consumo metabólico rápido de los principales recursos energéticos en el cerebro con la pérdida de fosfo-creatina (P-creatina) siendo el más rápido, seguido de glucosa, trifosfato de adenosina (ATP), y glucógeno4. La preservación de ATP es de particular importancia para la salud a largo plazo de las rebanadas cerebrales, ya que el ATP es necesario para mantener el potencial de membrana a través de la ATPase Na-K, y en consecuencia la actividad neuronal5,6. El nivel de ATP en el cerebro de los roedores adultos es de 2,5 mM, y cae precipitadamente dentro de 20 s de decapitación para alcanzar un estado estacionario basal (0,5 mM) en alrededor de 1 min después de la decapitación4,7,8. En animales jóvenes, se tarda más en observar la misma caída en ATP (2 min); con anestesia fenobarbital se ralentiza aún más a 4 min4. Estas consideraciones muestran que prevenir la pérdida de ATP y otros recursos energéticos es una estrategia necesaria para prevenir el daño hipoxico al cerebro y a su vez para mantener la salud de las rebanadas cerebrales durante períodos más largos de tiempo, especialmente en animales adultos.

Las bajas temperaturas ralentizan el metabolismo. Por lo tanto, se ha demostrado que la hipotermia modesta protege las reservas de energía cerebral: en animales jóvenes, reduciendo la temperatura corporal en seis grados, de 37 oC a 31 oC, preserva los niveles de ATP a alrededor del 80% de los niveles normales durante 4 h de hipoxia controlada9. Los niveles de P-creatina se conservan de manera similar, así como el potencial general de fosforilación9. Esto sugiere que bajar la temperatura corporal antes de la decapitación podría ser neuroprotector, como niveles casi normales de ATP podrían mantenerse a través de los períodos de corte por rebanada y recuperación de la rebanada.

En la medida en que una caída de ATP no se puede prevenir completamente tras la decapitación, se espera una función parcialmente deteriorada de la ATPase Na-K, seguida de la despolarización a través de la afluencia pasiva de sodio. Como la afluencia pasiva de sodio es seguida por la entrada de agua en las células, causa edema citotóxico y eventualmente piknosis. En ratas adultas, la sustitución de iones Na+ por sacarosa en soluciones de corte por rodajas ha sido una estrategia exitosa para aliviar la carga del edema citotóxico10,11. Más recientemente, los cationes orgánicos metilados que disminuyen la permeabilidad del canal de sodio12 han demostrado ofrecer una protección más eficaz que la sacarosa, especialmente en rodajas de ratones adultos, siendo N-metil-D-glucamina (NMDG) más ampliamente aplicable en diferentes edades y regiones cerebrales13,,14,,15,,16.

Numerosos protocolos de corte cerebral implican el uso de temperaturas frías sólo durante el paso de corte por rebanadas, a veces en combinación con La estrategia de reemplazo de Na+ ion16,17. En animales jóvenes, estos protocolos parecen ofrecer suficiente neuroprotección ya que los cerebros se pueden extraer rápidamente después de la decapitación porque el cráneo es todavía delgado y fácil de eliminar3. Sin embargo, esta estrategia no produce rebanadas saludables de animales adultos. Con el tiempo, varios laboratorios que estudian roedores adultos han introducido la perfusión transcardial con una solución helada para disminuir la temperatura corporal del animal, y por lo tanto daño hipoxico al cerebro, antes de la decapitación. Este procedimiento se aplicó con éxito para producir rodajas cerebelosas18, rodajas de cerebro medio19, rodajas neocorticales11,20, corteza perirhinal21, hipocampo de rata10,22,23, bulbo olfativo24, estriado ventral25, corteza visual26.

A pesar de las ventajas que ofrece la perfusión transcardial y el reemplazo de iones Na+ en la preparación de rodajas de rata y en algunas regiones cerebrales en ratones, el hipocampo de ratón sigue siendo una de las zonas más desafiantes para protegerse de la hipoxia13,,20. Hasta la fecha, uno de los enfoques más comunes para cortar el hipocampo de ratones envejecidos y modelos de ratón de neurodegeneración implica el corte rápido clásico del hipocampo aislado27. En el protocolo descrito aquí, minimizamos la pérdida de ATP en el cerebro adulto mediante la introducción de hipotermia antes de la decapitación perfundiendo transcardimente al animal con el frío helado Na+– fluido cefalorraquídeo artificial basado en NMDG libre (NMDG-aCSF). Las rebanadas se cortan en Na+libre de hielo NMDG-aCSF. Con este protocolo mejorado obtenemos rebanadas agudas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos que son saludables hasta 10 h después del corte y son apropiados para grabaciones de campo a largo plazo y estudios de parches.

Protocol

El protocolo se lleva a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford. Los métodos también están de acuerdo con las Políticas de la Sociedad para la Neurociencia sobre el Uso de Animales y Humanos en la Investigación de Neurociencia. NOTA: Todos los ratones se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos. Ratones de tipo…

Representative Results

Aplicamos el protocolo anterior para generar rebanadas de hipocampo de CamKIIa-Cre+; Ratones WT sobre un fondo genético mixto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, en P > 120. Un gran número de células piramidales en el campo CA1 (Figura 2A) y subiculum (Figura 2B) aparecen en bajo contraste cuando se observan bajo microscopía de contraste diferencial infrarrojo (IR-DIC), un sello distintivo de las células sanas en la preparación de una rebanada. Con esta preparación, una…

Discussion

El protocolo descrito aquí demuestra que las rebanadas de hipocampo obtenidas de ratones adultos y envejecidos pueden permanecer saludables y viables durante muchas horas después del corte. Los sectores preparados con este protocolo son adecuados para grabaciones de abrazaderas de parches, así como grabaciones de campo de larga duración en las regiones CA1.

Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primer paso es el paso de perfusión transcardial con una solución helada. El aclaramie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradezco a la Dra. Carla J. Shatz por consejo y apoyo, y a la Dra. Barbara K. Brott y Michelle K. Drews por leer críticamente el manuscrito. El trabajo es apoyado por NIH EY02858 y la Fundación Mathers Charitable otorga a CJS.

Materials

“60 degree” tool made in-house
#10 scalpel blade Bard-Parker (Aspen Surgical) 371110
1M CaCl2 Fluka Analytical 21114
95%O2/5%CO2 Praxiar or another local supplier
Acepromazine maleate (AceproJect) Henry Schein 5700850
Agar Fisher BP1423-500
Beakers, measuring cylinders, reagent bottles
Brushes size 00-2 Ted Pella Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.
CCD camera Olympus XM10
Choline bicarbonate Pfalz & Bauer C21240
Cyanoacrilate glue Krazy glue Singles
Decapitation scissors FST 14130-17
Feather blades Feather FA-10
Filter paper #2 Whatman Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.
Forceps A. Dumont & Fils Inox 3c
Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 Robuglas.com 18103 or 18113 Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.
Glucose Sigma-Aldrich G8270
HCl Fisher A144SI-212
Ice buckets
KCl Sigma-Aldrich P4504
Ketamine HCl (KetaVed) VEDCO NDC 50989-996-06
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662
Leica Tissue slicer VT1000S The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2
Magnetic stirrers and stir bars
Mg2SO4 x 7H2O Sigma-Aldrich 230391
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
MilliQ water machine Millipore Source for 18 Mohm water
Na-ascorbate Sigma-Aldrich A4035
Na-pyruvate Sigma-Aldrich P8574
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaHCO3 EMD SX0320-1
Needle 27G1/2
NMDG Sigma-Aldrich M2004
Paper tape
Peristaltic pump Cole-Parmer #7553-70
Peristaltic pump head Cole-Parmer Masterflex #7518-00
Personna blades Personna double edge Amazon
pH meter
Recovery chamber in-house made
Scalpel blade handle size 3 Bard-Parker (Aspen Surgical) 371030
Scissors angled blade FST 14081-09
Single edge industrial razor blade #9 VWR 55411
Spatulas
Transfer pipettes Samco Scientific 225
Upright microscope Olympus BX51WI
Xylazine HCl (XylaMed) VetOne 510650

References

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Cite This Article
Djurisic, M. Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice. J. Vis. Exp. (161), e61377, doi:10.3791/61377 (2020).

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