מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

הופעתם של ההכנות לחתיכה מוחית חריפה של היונקים הקלה על ניסויים ברמה התאית והסינופטית שהיו אפשריים בעבר רק בהכנות חסרי חוליות כמו Aplysia¹. פיתוח פרוסות היפוקמפוס אקוטיות היה בעל משמעות מיוחדת, כפי שהוא מבנה אחראי על זיכרון עבודה היווצרות הקשר, ויש לו מעגלים תלת-סינפטיים מיוחדים כי הוא נוח מניפולציה פיזיולוגית קלה. עם זאת, הרוב המכריע של פרוסות מוח אקוטיות עדיין מוכנים מעכברים וחולדות צעירים יחסית, כפי שקל יותר לשמר נוירונים ומעגלים בריאים, ואת הפרוסות להישאר קיימא לפרקי^{זמן ארוכים יותר 2,,3,,4}. כאן, אנו מציגים שינויים בפרוטוקולי חיתוך סטנדרטיים התוצאתם כדאיות מוגברת של פרוסות היפוקמפוס אקוטיות מעכברים בוגרים ומזדקנים.

המכשול העיקרי לכדאיות vivo לשעבר לטווח ארוך של parenchyma המוח יונקים הוא הנזק היפוקסי הראשוני המתרחשת במהירות ברגע זרימת הדם למוח מפסיק בעקבות עריפת ראש. אובדן חמצן גורם לצריכה חילוף חומרים מהירה של משאבי אנרגיה עיקריים במוח עם אובדן של פוספו-קריאטין (P-קריאטין) להיות המהיר ביותר, ואחריו גלוקוז, אדנוזין טריפוספט (ATP), וגלוקוגן^4. שימור ATP הוא בעל חשיבות מיוחדת לבריאות לטווח ארוך של פרוסות מוח, כמו ATP נדרש כדי לשמור על פוטנציאל קרום באמצעות ATPase Na-K, וכתוצאה מכך את הפעילות^{העצבית 5,6}. רמת ה-ATP במוח המכרסמים הבוגרים היא כ-2.5 מ”מ, והיא יורדת במהירות בתוך 20 שניות של עריפת ראש כדי להגיע למצב יציב של בסיס (כ-0.5 מ”מ) בסביבות דקה לאחר עריפת^{ראש 4,,7,,8}. בבעלי חיים צעירים, לוקח יותר זמן לצפות באותה ירידה ATP (~ 2 דקות); עם הרדמה פנוברביטל הוא הואט עוד יותר 4 דקות⁴. שיקולים אלה מראים כי מניעת אובדן ATP ומשאבי אנרגיה אחרים היא אסטרטגיה הכרחית כדי למנוע נזק היפוקסי למוח ובכך כדי לשמור על הבריאות של פרוסות המוח על פני פרקי זמן ארוכים יותר, במיוחד בבעלי חיים בוגרים.

טמפרטורות נמוכות מאטות את חילוף החומרים. כתוצאה מכך, הוכח כי היפותרמיה צנועה מגנה על עתודות אנרגיית המוח: בבעלי חיים צעירים, הורדת טמפרטורת הגוף בשש מעלות, מ 37 °C ל 31 ° C, משמרת את רמות ATP סביב 80% של רמות נורמליות מעל 4 שעות של היפוקסיה^{מבוקרת 9}. רמות P-קריאטין נשמרים באופן דומה, כמו גם פוטנציאל פוספורילציה^{הכוללת 9}. זה מצביע על כך שהורדת טמפרטורת הגוף לפני עריפת ראש יכול להיות neuroprotective, כמו רמות כמעט נורמליות של ATP יכול להישמר באמצעות חיתוך פרוסה ופרוסה התאוששות תקופות.

במידה כי ירידה ATP לא ניתן למנוע לחלוטין על עריפת ראש, פונקציה לקויה חלקית של ATPase Na-K צפוי, ואחריו depolarization באמצעות זרם נתרן פסיבי. כמו זרם נתרן פסיבי מלווה בכניסת מים לתאים, זה גורם בצקת ציטוקוקסית ובסופו של דבר פיקנוזיס. בחולדות בוגרות, החלפת יונים Na+ עם סוכרוז בפתרונות חיתוך פרוסה כבר אסטרטגיה מוצלחת כדי להקל על הנטל של בצקת cytotoxic^10,11. לאחרונה, cations אורגני מתילציה המפחיתים חחול^{ערוץ נתרן 12 הראו להציע הגנה} יעילה יותר מאשר סוכרוז, במיוחד פרוסות מעכברים בוגרים, עם N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG) להיות ישים ביותר על פני גילאים שונים ואזורי מוח^{13,,14,,15,,16}.

פרוטוקולים רבים לחיתוך מוח כרוכים בשימוש בטמפרטורות קרות רק במהלך שלב חיתוך הפרוסה, לעתים בשילוב עם Na⁺ ion החלפת^{אסטרטגיה 16,17}. בבעלי חיים צעירים, פרוטוקולים אלה מופיעים להציע הגנה עצבית מספקת מאז המוח ניתן לחלץ במהירות לאחר עריפת ראש כי הגולגולת היא עדיין רזה וקל להסיר^3. עם זאת, אסטרטגיה זו אינה מייצרת פרוסות בריאות מבעלי חיים בוגרים. עם הזמן, מספר מעבדות החוקרות מכרסמים בוגרים הציגו זיעה בין-לבית עם תמיסה קרה כקרח כדי להקטין את טמפרטורת הגוף של החיה, ולכן נזק היפוקסי למוח, לפני עריפת ראש. הליך זה הוחל בהצלחה כדי לייצר פרוסות המוח¹⁸, פרוסות המוח האמצעי¹⁹, פרוסות neocortical^11,20, קליפת פריהינלית²¹, היפוקמפוס^{חולדה 10},^22,23, נורה^{חוש הריח 24}, סטריאטום^{אוורור 25}, קליפת המוח^{,החזותית 26}.

למרות היתרונות המוצעים על ידי עירוי transcardial ו Na⁺ תחליף יון בהכנת פרוסות מעכברוש ובאיזורים מסוימים במוח בעכברים, היפוקמפוס העכבר נשאר אחד האזורים המאתגרים ביותר כדי להגן מפני היפוקסיה^13,20. עד כה, אחת הגישות הנפוצות ביותר לחיתוך היפוקמפוס מעכברים מזדקנים ומודלים עכבר של ניוון עצבי כרוך חיתוך מהיר קלאסי של היפוקמפוס מבודד²⁷. בפרוטוקול המתואר כאן, אנו ממזערים את אובדן ATP במוח הבוגר על ידי הצגת היפותרמיה לפני עריפת הראש על ידי חפירת החיה באופן טראנס-קר עם Na קר כקרח⁺– נוזל מוחי מוחי מלאכותי מבוסס NMDG חינם (NMDG-aCSF). לאחר מכן, הפרוסות נחתכו ב-Na^{הקר כקרח +}NMDG-aCSF ללא תשלום. עם פרוטוקול משופר זה אנו מקבלים פרוסות היפוקמפוס חריפה מעכברים בוגרים ומזדקנים כי הם בריאים עד 10 שעות לאחר חיתוך ומתאימים לטווח ארוך שדה הקלטות מחקרים טלאי-מהדק.