Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

El advenimiento de las preparaciones agudas de la rebanada cerebral de los mamíferos facilitó experimentos a nivel celular y sináptico que antes sólo eran posibles en preparaciones de invertebrados como Aplysia¹. El desarrollo de rebanadas agudas del hipocampo fue de particular importancia, ya que es una estructura responsable de la memoria de trabajo y la formación de contexto, y tiene un circuito trisináptico especializado que es amenable a la manipulación fisiológica fácil. Sin embargo, la gran mayoría de las rebanadas cerebrales agudas todavía se preparan a partir de ratones y ratas relativamente jóvenes, ya que es más fácil preservar las neuronas y circuitos sanos, y las rebanadas siguen siendo viables durante períodos más largos de tiempo^2,,3,,4. Aquí, introducimos modificaciones en los protocolos de corte estándar que resultan en una mayor viabilidad de las rodajas agudas del hipocampo de ratones adultos y envejecidos.

El principal impedimento para la viabilidad ex vivo a largo plazo del parénquima cerebral de los mamíferos es el daño hipoxico inicial que ocurre rápidamente una vez que el flujo sanguíneo al cerebro deja de disminuir. La pérdida de oxígeno resulta en un consumo metabólico rápido de los principales recursos energéticos en el cerebro con la pérdida de fosfo-creatina (P-creatina) siendo el más rápido, seguido de glucosa, trifosfato de adenosina (ATP), y glucógeno⁴. La preservación de ATP es de particular importancia para la salud a largo plazo de las rebanadas cerebrales, ya que el ATP es necesario para mantener el potencial de membrana a través de la ATPase Na-K, y en consecuencia la actividad neuronal^5,6. El nivel de ATP en el cerebro de los roedores adultos es de 2,5 mM, y cae precipitadamente dentro de 20 s de decapitación para alcanzar un estado estacionario basal (0,5 mM) en alrededor de 1 min después de la decapitación^4,7,8. En animales jóvenes, se tarda más en observar la misma caída en ATP (2 min); con anestesia fenobarbital se ralentiza aún más a 4 min⁴. Estas consideraciones muestran que prevenir la pérdida de ATP y otros recursos energéticos es una estrategia necesaria para prevenir el daño hipoxico al cerebro y a su vez para mantener la salud de las rebanadas cerebrales durante períodos más largos de tiempo, especialmente en animales adultos.

Las bajas temperaturas ralentizan el metabolismo. Por lo tanto, se ha demostrado que la hipotermia modesta protege las reservas de energía cerebral: en animales jóvenes, reduciendo la temperatura corporal en seis grados, de 37 oC a 31 oC, preserva los niveles de ATP a alrededor del 80% de los niveles normales durante 4 h de hipoxia controlada^9. Los niveles de P-creatina se conservan de manera similar, así como el potencial general de fosforilación⁹. Esto sugiere que bajar la temperatura corporal antes de la decapitación podría ser neuroprotector, como niveles casi normales de ATP podrían mantenerse a través de los períodos de corte por rebanada y recuperación de la rebanada.

En la medida en que una caída de ATP no se puede prevenir completamente tras la decapitación, se espera una función parcialmente deteriorada de la ATPase Na-K, seguida de la despolarización a través de la afluencia pasiva de sodio. Como la afluencia pasiva de sodio es seguida por la entrada de agua en las células, causa edema citotóxico y eventualmente piknosis. En ratas adultas, la sustitución de iones Na+ por sacarosa en soluciones de corte por rodajas ha sido una estrategia exitosa para aliviar la carga del edema citotóxico^10,11. Más recientemente, los cationes orgánicos metilados que disminuyen la permeabilidad del canal de sodio¹² han demostrado ofrecer una protección más eficaz que la sacarosa, especialmente en rodajas de ratones adultos, siendo N-metil-D-glucamina (NMDG) más ampliamente aplicable en diferentes edades y regiones cerebrales^{13,,14,,15,,16}.

Numerosos protocolos de corte cerebral implican el uso de temperaturas frías sólo durante el paso de corte por rebanadas, a veces en combinación con La estrategia de reemplazo de Na⁺ ion^16,17. En animales jóvenes, estos protocolos parecen ofrecer suficiente neuroprotección ya que los cerebros se pueden extraer rápidamente después de la decapitación porque el cráneo es todavía delgado y fácil de eliminar³. Sin embargo, esta estrategia no produce rebanadas saludables de animales adultos. Con el tiempo, varios laboratorios que estudian roedores adultos han introducido la perfusión transcardial con una solución helada para disminuir la temperatura corporal del animal, y por lo tanto daño hipoxico al cerebro, antes de la decapitación. Este procedimiento se aplicó con éxito para producir rodajas cerebelosas¹⁸, rodajas de cerebro medio¹⁹, rodajas neocorticales^11,20, corteza perirhinal²¹, hipocampo de rata^10,22,23, bulbo olfativo²⁴, estriado ventral²⁵, corteza visual²⁶.

A pesar de las ventajas que ofrece la perfusión transcardial y el reemplazo de iones Na⁺ en la preparación de rodajas de rata y en algunas regiones cerebrales en ratones, el hipocampo de ratón sigue siendo una de las zonas más desafiantes para protegerse de la hipoxia^13,,20. Hasta la fecha, uno de los enfoques más comunes para cortar el hipocampo de ratones envejecidos y modelos de ratón de neurodegeneración implica el corte rápido clásico del hipocampo aislado^27. En el protocolo descrito aquí, minimizamos la pérdida de ATP en el cerebro adulto mediante la introducción de hipotermia antes de la decapitación perfundiendo transcardimente al animal con el frío helado Na⁺– fluido cefalorraquídeo artificial basado en NMDG libre (NMDG-aCSF). Las rebanadas se cortan en Na⁺libre de hielo NMDG-aCSF. Con este protocolo mejorado obtenemos rebanadas agudas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos que son saludables hasta 10 h después del corte y son apropiados para grabaciones de campo a largo plazo y estudios de parches.