Summary

Transporte axónico de organelos en cultivos de neuronas motoras utilizando el sistema de cámaras microfluídicas

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de las neuronas motoras. En este protocolo proporcionamos un método detallado para el seguimiento del transporte axonal de compartimentos ácidos y mitocondrias en axons de neuronas motoras utilizando cámaras microfluídicas.

Abstract

Las neuronas motoras (MN) son células altamente polarizadas con axones muy largos. El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de la MN, contribuyendo al crecimiento neuronal, desarrollo, y la supervivencia. Describimos un método detallado para el uso de cámaras microfluídicas (MFC) para el seguimiento del transporte axonal de orgánulos etiquetados fluorescentemente en axones MN. Este método es rápido, relativamente barato, y permite el monitoreo de señales intracelulares en el espacio y el tiempo. Describimos un protocolo paso a paso para: 1) Fabricación de MFC de polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimiento de explantes de la médula espinal ventral y cultivo disociado MN en MFC; 3) Etiquetado de mitocondrias y compartimentos ácidos seguidode de imaginación confocal viva; 4) Análisis manual y semiautomatizado del transporte axonal. Por último, demostramos una diferencia en el transporte de mitocondrias y compartimentos ácidos de HB9::GFP de la médula espinal ventral explantó axons como prueba de la validez del sistema. En conjunto, este protocolo proporciona una herramienta eficaz para estudiar el transporte axonal de varios componentes axonales, así como un manual simplificado para el uso de MFC para ayudar a descubrir posibilidades experimentales espaciales.

Introduction

Las MN son células altamente polarizadas con axones largos, alcanzando hasta un metro de largo en humanos adultos. Este fenómeno crea un desafío crítico para el mantenimiento de la conectividad y la función MN. En consecuencia, los MN dependen del transporte adecuado de información, orgánulos y materiales a lo largo de los axones desde su cuerpo celular hasta la sinapsis y la espalda. Varios componentes celulares, como proteínas, ARN y orgánulos, se transportan regularmente a través de los axones. Las mitocondrias son orgánulos importantes que se transportan rutinariamente en MNs. Mitocondrias son esenciales para la actividad adecuada y el funcionamiento de los MN, responsables de la provisión de ATP, amortiguación de calcio, y procesos de señalización1,2. El transporte axonal de mitocondrias es un proceso bien estudiado3,4. Curiosamente, se informó que los defectos en el transporte mitocondrial estaban implicados en varias enfermedades neurodegenerativas y específicamente en enfermedades MN5. Los compartimentos ácidos sirven como otro ejemplo para los orgánulos intrínsecos que se mueven a lo largo de los axones MN. Los compartimentos ácidos incluyen lysososomes, endosomas, aparatos trans-Golgi, y ciertas vesículas secretoras6. Los defectos en el transporte axonal de compartimentos ácidos se encontraron en varias enfermedades neurodegenerativas, así como7,y los documentos recientes destacan su importancia en las enfermedades MN8.

Para estudiar eficientemente el transporte axonal, las cámaras microfluídicas que separan los compartimentos somáticos y axonales se utilizan con frecuencia9,10. Las dos ventajas significativas del sistema microfluídico, y la compartimentación y el aislamiento de los axons, lo hacen ideal para el estudio de procesos subcelulares11. La separación espacial entre los cuerpos celulares neuronales y los axons se puede utilizar para manipular los entornos extracelulares de diferentes compartimentos neuronales (por ejemplo, axones vs. soma). Los ensayos bioquímicos, de crecimiento/degeneración neuronal e inmunofluorescencia se benefician de esta plataforma. Las MFC también pueden ayudar a estudiar la comunicación de célula a célula cocultando neuronas con otros tipos de células, como los músculos esqueléticos12,,13,,14.

Aquí, describimos un protocolo simple pero preciso para monitorear las mitocondrias y el transporte del compartimiento ácido en las neuronas motoras. Además, mostramos el uso de este método comparando el porcentaje relativo de orgánulos en movimiento retrógrados y anterogrados, así como la distribución de la velocidad de transporte.

Protocol

El cuidado y tratamiento de los animales en este protocolo se llevó a cabo bajo la supervisión y aprobación del Comité Universitario de Ética Animal de Tel Aviv. 1. Preparación MFC Fundición PDMS en moldes primarios (Figura 1) Comprar o crear moldes primarios (wafers) siguiendo un protocolo detallado9. Utilice aire presurizado para eliminar cualquier tipo de suciedad de la plataforma de obleas antes de pr…

Representative Results

Siguiendo el protocolo descrito, los explantes de la médula espinal embrionario de ratón HB9::GFP se cultivaron en MFC(Figura 4A). Los explantas se cultivaron durante 7 días, cuando los axons se cruzaron completamente en el compartimiento distal. Se añadieron colores rojos Mitotracker Deep Red y Lysotracker a los compartimentos distales y proximales para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos(Figura 4…

Discussion

En este protocolo, describimos un sistema para rastrear el transporte axonal de mitocondrias y compartimentos ácidos en las neuronas motoras. Esta plataforma in vitro simplificada permite un control, monitoreo y manipulación precisos de los compartimentos neuronales subcelulares, lo que permite el análisis experimental de las funciones locales de las neuronas motoras. Este protocolo puede ser útil para el estudio de enfermedades MN como la ELA, para centrarse en la comprensión del mecanismo subyacente de la disfunci…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Israel Science (ISF, 561/11) y del Consejo Europeo de Investigación (ERC, 309377).

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

References

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Cite This Article
Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

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