Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System
Summary
Der axonale Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die Gesundheit des motorischen Neurons. In diesem Protokoll bieten wir eine detaillierte Methode zur Verfolgung des axonalen Transports von sauren Kompartimenten und Mitochondrien in motorischen Neuronaxonen mit mikrofluidischen Kammern.
Abstract
Motorneuronen (MNs) sind hochpolarisierte Zellen mit sehr langen Axonen. Axonaler Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die MN-Gesundheit und trägt zu neuronalen Wachstum, Entwicklung und Überleben bei. Wir beschreiben eine detaillierte Methode zur Verwendung von mikrofluidischen Kammern (MFCs) zur Verfolgung des axonalen Transports von fluoreszierend markierten Organellen in MN-Axonen. Diese Methode ist schnell, relativ kostengünstig und ermöglicht die Überwachung intrazellulärer Hinweise in Raum und Zeit. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für: 1) Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) MFCs; 2) Beschichtung von ventralen Rückenmarksexaten und MN dissoziierte Kultur in MFCs; 3) Kennzeichnung von Mitochondrien und sauren Kompartimenten, gefolgt von einer lebendigen konfokalen Vorstellung; 4) Manuelle und halbautomatische axonale Transportanalyse. Schließlich zeigen wir einen Unterschied im Transport von Mitochondrien und sauren Kompartimenten von HB9::GFP ventrale Rückenmarks-Explantationsaxone als Beweis für die Systemgültigkeit. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung des axonalen Transports verschiedener axonaler Komponenten sowie ein vereinfachtes Handbuch für die MFC-Nutzung, um räumliche experimentelle Möglichkeiten zu entdecken.
Introduction
MNs sind hochpolarisierte Zellen mit langen Axonen, die bei erwachsenen Menschen bis zu einem Meter lang sind. Dieses Phänomen stellt eine kritische Herausforderung für die Aufrechterhaltung der MN-Konnektivität und -Funktion dar. Folglich sind MNs auf den richtigen Transport von Informationen, Organellen und Materialien entlang der Axone von ihrem Zellkörper zur Synapse und zurück angewiesen. Verschiedene zelluläre Komponenten, wie Proteine, RNA und Organellen werden regelmäßig durch die Axone transportiert. Mitochondrien sind wichtige Organellen, die routinemäßig in MNs transportiert werden. Mitochondrien sind essentiell für die richtige Aktivität und Funktion von MNs, verantwortlich für ATP-Versorgung, Kalziumpufferung und Signalisierungsprozesse1,2. Der axonale Transport von Mitochondrien ist ein gut untersuchter Prozess3,4. Interessanterweise wurden Defekte im mitochondrialen Transport berichtet, dass sie an mehreren neurodegenerativen Erkrankungen und speziell an MN-Erkrankungen beteiligt waren5. Saure Fächer dienen als weiteres Beispiel für intrinsische Organellen, die sich entlang von MN-Axonen bewegen. Saure Kompartimente umfassen Lysosomen, Endosomen, Trans-Golgi-Apparate und bestimmte sekretole Vesikel6. Defekte im axonalen Transport von sauren Kompartimenten wurden bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen sowie7gefunden, und neuere Papiere unterstreichen ihre Bedeutung bei MN-Erkrankungen8.
Zur effizienten Untersuchung des axonalen Transports werden häufig mikrofluidische Kammern verwendet, die somatische und axonale Kompartimente trennen9,10. Die beiden wesentlichen Vorteile des mikrofluidischen Systems und die Abschottung und Isolierung von Axonen machen es ideal für die Untersuchung subzellulärer Prozesse11. Die räumliche Trennung zwischen den neuronalen Zellkörpern und Axonen kann verwendet werden, um die extrazellulären Umgebungen verschiedener neuronaler Kompartimente (z. B. Axone vs. Soma) zu manipulieren. Biochemische, neuronale Wachstum/Degeneration und Immunfluoreszenz-Assays profitieren alle von dieser Plattform. MFCs können auch bei der Untersuchung der Zell-zu-Zell-Kommunikation helfen, indem sie Neuronen mit anderen Zelltypen kokultieren, wie Skelettmuskeln12,13,14.
Hier beschreiben wir ein einfaches, aber präzises Protokoll zur Überwachung von Mitochondrien und sauren Kompartimententransporten in motorischen Neuronen. Wir zeigen die Anwendung dieser Methode weiter, indem wir den relativen Prozentsatz der retrograden und anterogradbewegten Organellen sowie die Verteilung der Transportgeschwindigkeit vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir ein System zur Verfolgung des axonalen Transports von Mitochondrien und sauren Kompartimenten in motorischen Neuronen. Diese vereinfachte In-vitro-Plattform ermöglicht eine präzise Steuerung, Überwachung und Manipulation subzellulärer neuronaler Kompartimente und ermöglicht eine experimentelle Analyse der lokalen Funktionen des motorischen Neurons. Dieses Protokoll kann nützlich sein, um MN-Erkrankungen wie ALS zu studieren, um sich auf das Verständnis des zugrunde liegenden Mec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Israel Science Foundation (ISF, 561/11) und des Europäischen Forschungsrates (ERC, 309377) unterstützt.
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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