Summary

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ’יימברס.

Abstract

מוטוריים נוירונים (MNs) הם תאים מקוטב מאוד עם axons ארוכים מאוד. הובלה axonal היא מנגנון מכריע עבור בריאות MN, לתרום צמיחה עצבית, פיתוח, והישרדות. אנו מתארים שיטה מפורטת לשימוש בתאי מיקרו-פלואידים (mfcs) למעקב אחר העברת אקונאליות של אורגלים בעלי תווית של מוצרים בעלי מחשב בצורת סיבי MN. שיטה זו היא מהירה, זולה יחסית, ומאפשרת ניטור של רמזים תאיים בחלל ובזמן. אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול עבור: 1) ייצור של polydiמתיל siloxane (PDMS) MFCs; 2) ציפוי של הרחבות בחוט השדרה והתרבות המונתק של MN ב-MFCs; 3) הוספת תוויות לתאי המיטומטר וחומציים בעקבות הדמיון הישיר; 4) ניתוח הובלה באופן ידני וחצי אוטומטי. לבסוף, אנו להפגין הבדל בהובלה של תאים חומציים וחומצי של HB9:: gfp ובעל חוט השדרה לחקור אקסונים כהוכחה של תוקף המערכת. לגמרי, פרוטוקול זה מספק כלי יעיל ללימוד התחבורה סיבי של רכיבי סיבי שונים, כמו גם מדריך פשוט עבור שימוש MFC כדי לעזור לגלות אפשרויות ניסיוני מרחבי.

Introduction

MNs הם תאים מקוטנים מאוד עם axons ארוכים, מגיע עד מטר אחד באורך של בני אדם למבוגרים. תופעה זו יוצרת אתגר קריטי לשמירה על קישוריות ותפקוד של MN. כתוצאה מכך, MNs תלויה בהובלה תקינה של מידע, אורגלים וחומרים לאורך האקסונים מהגוף הסלולארי שלהם אל הסינפסה וחזרה. רכיבים סלולאריים שונים, כגון חלבונים, RNA ואורגלים, מדילג באופן סדיר דרך האקסונים. מיטוכונמיטויום הם אורגלים חשובים אשר מועברים באופן שגרתי ב-MNs. מיטוגרם הם חיוניים לפעילות תקינה ולתפקוד של MNs, האחראי על הוראת ATP, אגירת סידן ותהליכי איתות1,2. התחבורה האקונלית של המיטו, היא תהליך לומד היטב3,4. מעניין, פגמים בתחבורה מיטוכונדריאלי דווחו להיות מעורבים במספר מחלות ניווניות ובמיוחד במחלות MN5. התאים החומציים משמשים כדוגמה נוספת לאורגלים פנימיים הזזים לאורך MN axons. תאי חומציים כוללים ליזוזומים, אנזומים, מכשירי טרנס-גולג’י ושלפוחיות מסוימות. פגמים בתחבורה סיבי של תאים חומציים נמצאו במספר מחלות ניווניות כמו גם7, העיתונים האחרונים להדגיש את חשיבותם במחלות MN8.

כדי לחקור ביעילות את התחבורה סיבי, מיקרופלואידיג צ’יימברס המפרידים בין התאים הסומונטיים והאקאליות משמשים לעתים קרובות9,10. שני היתרונות המשמעותיים של מערכת המיקרופלואידיג, והתקשורת והבידוד של האקסונים, מעבדים אותו באופן אידיאלי ללימוד תהליכים תת-תאיים11. ניתן להשתמש בהפרדה המרחבית בין גופי התאים העצביים לבין האקסונים כדי לתמרן את סביבות החילוץ של התאים העצביים השונים (לדוגמה, אקסונים vs. סומה). , והתנוונות שהכל מהווה תועלת. מפלטפורמה זו Mfcs יכול גם לסייע ללמוד תקשורת תא לתאים על ידי הנוירונים coculturing עם סוגי תאים אחרים, כגון שרירי השלד12,13,14.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אך מדויק עבור ניטור המיטו, התחבורה תא חומצי בתוך נוירונים מוטוריים. אנו מציגים את השימוש בשיטה זו על-ידי השוואת האחוז היחסי של מארגני נסיגה וכיתות מעבר, כמו גם הפצת מהירות התחבורה.

Protocol

טיפול בבעלי חיים בפרוטוקול זה בוצע בפיקוח ובאישור הוועדה לאתיקה בעלי חיים באוניברסיטת תל אביב. 1. הכנה MFC הליהוק של PDMS בתבניות ראשיות (איור 1) לרכוש או ליצור תבניות ראשיות (וופלים) בעקבות פרוטוקול מפורט9. השתמש באוויר בלחץ כדי להסיר…

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר, עכבר עובריים HB9:: GFP בחוט השדרה האקסוצמחים היו מתורבתים ב-MFC (איור 4א). , האקסוצמחים גדלו במשך 7 ימים. כשהאקטונים הצטלבו לתוך התא המרוחק Mitotracker עמוק אדום ו Lysotracker צבעים אדום נוספו לתאי הבית הרחוק ביותר כדי לתייג את המיטוa ו חומצ…

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת כדי לעקוב אחר התחבורה סיבי של תאי המיטויונים ו חומצי ב נוירונים מוטוריים. זה פשוט בפלטפורמת מבחנה מאפשר שליטה מדויקת, ניטור, ומניפולציה של תאים עצביים תת-תאית, המאפשר ניתוח ניסיוני של התפקוד המקומי בתאי עצב. פרוטוקול זה יכול להועיל ללימוד מחלות MN כגון ALS, כדי ל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הישראלית (קרן, 561/11) ומועצת המחקר האירופית (ERC, 309377).

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

References

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Play Video

Cite This Article
Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

View Video