マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送
Summary
軸索輸送は運動ニューロンの健康にとって重要なメカニズムです。このプロトコルでは、マイクロ流体室を用いた運動ニューロン軸索における酸性コンパートメントおよびミトコンドリアの軸索輸送を追跡するための詳細な方法を提供する。
Abstract
運動ニューロン(MNs)は非常に長い軸索を持つ極偏光細胞です。軸索輸送はMNの健康にとって重要なメカニズムであり、神経の成長、発達、生存に寄与する。MN軸索における蛍光標識されたオルガネラの軸索輸送を追跡するためのマイクロ流体室(MFC)の使用法について詳細に説明する。この方法は、迅速で、比較的安価であり、空間および時間における細胞内の手がかりの監視を可能にする。我々は、ステッププロトコルをステップごとに記述する:1)ポリジメチルシロキサン(PDMS)の製造;2) MFCにおける腹側脊髄外植体およびMN解心培養のめっき;3)ミトコンドリアと酸性コンパートメントの標識後に生きた共焦点想像;4)手動および半自動軸索輸送分析。最後に、HB9:::GFP腹側脊髄外型軸索の輸送におけるHB9::GFP腹側脊髄の輸送の違いをシステムの有効性の証拠として示す。全体として、このプロトコルは、様々な軸索成分の軸索輸送を研究するための効率的なツールと、空間的実験的可能性を発見するのに役立つMFCの使用のための簡略化されたマニュアルを提供します。
Introduction
MNsは長い軸索を持つ非常に偏光細胞であり、成人の人間では最大1メートルに達する。この現象は、MN 接続性と機能の維持に重要な課題を生み出します。その結果、MNsは、細胞体からシナプスおよび背中への軸索に沿った情報、オルガネラ、および材料の適切な輸送に依存しています。タンパク質、RNA、オルガネラなどの様々な細胞成分は、軸索を介して定期的にシャトルされます。ミトコンドリアは、日常的にMNsで輸送される重要なオルガネラである. ミトコンドリアは、ATPの提供、カルシウムバッファリング、およびシグナリングプロセス11、22を担当するMNsの適切な活動および機能に不可欠である。ミトコンドリアの軸索輸送は、よく研究されたプロセス33、44です。興味深いことに、ミトコンドリア輸送における欠陥は、いくつかの神経変性疾患、特にMN疾患5に関与することが報告された。酸性コンパートメントは、MN軸索に沿って移動する固有のオルガネラの別の例として機能します。酸性コンパートメントは、リソソーム、エンドーソーム、トランスゴルジ装置、および特定の分泌小胞6を含む。酸性コンパートメントの軸索輸送の欠陥は、いくつかの神経変性疾患にも7で発見され、最近の論文はMN疾患におけるその重要性を強調した8。
効率的に軸索輸送を研究するために、体性および軸索コンパートメントを分離するマイクロ流体室は、多くの場合、9、10を10使用しています。マイクロ流体システムの2つの大きな利点と、区分化と軸索の単離は、細胞内プロセス11の研究に理想的である。神経細胞体と軸索の間の空間的分離は、異なる神経区画(例えば、軸索対ソーマ)の細胞外環境を操作するために使用することができる。生化学的、神経細胞の成長/変性、免疫蛍光アッセイはすべてこのプラットフォームから恩恵を受けます。MFCはまた、骨格筋12、13、14,13,14などの他の細胞タイプとニューロンを協調させることによって、細胞間コミュニケーションの研究を支援することができる。
ここでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメント輸送を監視するための、シンプルでありながら正確なプロトコルについて述べています。さらに、逆行性および前向き移動小器官の相対的な割合と輸送速度の分布を比較することによって、この方法の使用を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
本プロトコルでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメントの軸索輸送を追跡するシステムについて述べている。この簡素化されたin vitroプラットフォームにより、細胞下の神経区画の精密な制御、監視、操作が可能になり、運動ニューロン局所機能の実験的解析が可能になります。このプロトコルは、ALSなどのMN疾患を研究するのに有用であり、疾患<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イスラエル科学財団(ISF、561/11)と欧州研究評議会(ERC、309377)からの助成金によって支えられました。
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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