Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması
Summary
Aksonal taşıma motor nöron sağlığı için çok önemli bir mekanizmadır. Bu protokolde mikroakışkan odacıklar kullanılarak motor nöron aksonlarında asidik bölmelerin ve mitokondrinin aksonal naklinin izlenmesi için ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz.
Abstract
Motor nöronlar (MNs) çok uzun aksonlar ile yüksek polarize hücrelerdir. Aksonal ulaşım MN sağlığı için önemli bir mekanizmadır, nöronal büyüme katkıda, gelişme, ve sağkalım. MN aksonları floresan etiketli organellerin aksonal naklini izlemek için mikroakışkan odaların (MFCs) kullanımı için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem hızlı, nispeten ucuz, ve uzay ve zaman hücre içi ipuçları izlenmesi için izin verir. Biz için adım protokolü bir adım açıklar: 1) Polidimethylsiloxane imalatı (PDMS) MFCs; 2) MCD’lerde ventral omurilik eksplandisi ve MN ayrıştırılmış kültürün kaplaması; 3) Mitokondri ve asidik bölmelerin etiketlenmesi ve ardından canlı konfokal hayal; 4) Manuel ve yarı otomatik aksonal taşıma analizi. Son olarak, sistem geçerliliğinin bir kanıtı olarak MITOKONDRİ ve HB9 asidik bölmelerinin taşınmasında bir fark gösteriyoruz::GFP ventral omurilik ekstrkül aksonları. Bu protokol, çeşitli aksonal bileşenlerin aksonal taşımasını incelemek için etkili bir araç ve mekansal deneysel olasılıkları keşfetmeye yardımcı olmak için MFC kullanımı için basitleştirilmiş bir kılavuz sağlar.
Introduction
MN’ler uzun aksonlarla yüksek oranda polarize hücrelerdir ve yetişkin insanlarda bir metreye kadar uzundur. Bu fenomen, MN bağlantısının ve işlevinin sürdürülmesi için kritik bir sorun yaratır. Sonuç olarak, MN’ler aksonlar boyunca bilgi, organel ve malzemelerin hücre gövdesinden sinapsa ve sırta doğru şekilde taşınmasına bağlıdır. Proteinler, RNA ve organeller gibi çeşitli hücresel bileşenler aksonlar aracılığıyla düzenli olarak mekiklenir. Mitokondri rutin MNs taşınır önemli organeller vardır. Mitokondri UYGUN aktivite ve MNs fonksiyonu için gerekli olan, ATP sağlanması sorumlu, kalsiyum tamponlama, ve sinyalizasyon süreçleri1,2. Mitokondri aksonal taşıma iyi çalışılmış bir süreçtir3,4. İlginçtir, mitokondriyal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarve özellikle MN hastalıklarında dahil olduğubildirilmiştir 5. Asidik bölmeler MN akson boyunca hareket içsel organeller için başka bir örnek olarak hizmet vermektedir. Asidik bölmeler arasında izozomlar, endozomlar, trans-Golgi cihazları ve bazı salgı vezikülleri6bulunmaktadır. Asidik kompartmanların aksonal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda da bulundu7, ve son kağıtları MN hastalıklarında önemini vurgulamak8.
Aksonal taşımayı verimli bir şekilde incelemek için somatik ve aksonal bölmeleri birbirinden ayıran mikroakışkan bölmeler 9,10sıklıklakullanılmaktadır. Mikroakışkan sistemin iki önemli avantajı ve aksonları bölme ve izolasyon, hücre altı süreçlerin çalışması için ideal hale11. Nöronal hücre organları ve aksonları arasındaki mekansal ayrım, farklı nöronal bölmelerin hücre dışı ortamlarını (örn. aksonların soma’ya karşı) manipüle etmek için kullanılabilir. Biyokimyasal, nöronal büyüme/ dejenerasyon ve immünofloresan tsays tüm bu platformdan yarar. MFCs da diğer hücre tipleri ile nöronların koculturing hücre-hücre iletişimi çalışmalarında yardımcı olabilir, iskelet kasları gibi12,13,14.
Burada, motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartman naklinin izlenmesi için basit ama kesin bir protokol uyguluyoruz. Ayrıca retrograd ve anterograd hareketli organellerin göreceli yüzdesini ve taşıma hızının dağılımını karşılaştırarak bu yöntemin kullanımını da gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartmanların aksonal naklini takip edecek bir sistem tanımlıyoruz. Bu basitleştirilmiş in vitro platform hassas kontrol sağlar, izleme, ve subsellüler nöronal bölmelerin manipülasyon, motor nöron yerel fonksiyonların deneysel analizi sağlayan. Bu protokol, als gibi MN hastalıklarının incelenmesinde yararlı olabilir, hastalıkta aksonal taşıma disfonksiyonunun altında yatan mekanizmayı anlamaya odaklanmak için10,</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 561/11) ve Avrupa Araştırma Konseyi ‘nin (ERC, 309377) bağışları ile desteklenmiştir.
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
