Аксональный Транспорт органелл в культурах моторных нейронов с использованием системы микрофлюидных камер
Summary
Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья моторных нейронов. В этом протоколе мы предоставляем подробный метод отслеживания аксональной транспортировки кислых отсеков и митохондрий в моторных нейронных аксонах с помощью микрофлюидных камер.
Abstract
Моторные нейроны (Инн) являются сильно поляризованными клетками с очень длинными аксонами. Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья MN, способствуя росту нейронов, развитию и выживанию. Мы описываем подробный метод использования микрофлюидных камер (МФУ) для отслеживания аксональной транспортировки флуоресцентно маркированных органелл в аксонах MN. Этот метод является быстрым, относительно недорогим, и позволяет для мониторинга внутриклеточных сигналов в пространстве и времени. Мы описываем пошаговый протокол для: 1) Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) МФЦ; 2) Покрытие брюшной спинной мозг explants и MN диссоциированной культуры в МФЦ; 3) Маркировка митохондрий и кислых отсеков с последующим живым конфокальным воображением; 4) Ручной и полуавтоматизированный аксональный анализ транспорта. Наконец, мы демонстрируем разницу в транспортировке митохондрий и кислых отсеков HB9::GFP вентральный спинной мозг explant аксоны как доказательство действия системы. В целом, этот протокол обеспечивает эффективный инструмент для изучения аксонального переноса различных аксональных компонентов, а также упрощенное руководство по использованию MFC, чтобы помочь обнаружить пространственные экспериментальные возможности.
Introduction
MNs являются сильно поляризованными клетками с длинными аксонами, достигающими до одного метра в длину у взрослых людей. Это явление создает критическую проблему для поддержания подключения и функции MN. Следовательно, MNs зависит от надлежащей транспортировки информации, органелл ы и материалов вдоль аксонов от их клеточного тела к синапсу и спине. Различные клеточные компоненты, такие как белки, РНК и органеллы регулярно переносятся через аксоны. Митохондрии являются важными органеллами, которые регулярно транспортируются в MNs. Митохондрии имеют важное значение для надлежащей деятельности и функции MNs, ответственных за предоставление АТФ, буферизации кальция, и сигнализации процессов1,2. Аксональный транспорт митохондрий является хорошо изученным процессом3,,4. Интересно, что дефекты в митохондриальной транспортировки, как сообщается, участвуют в нескольких нейродегенеративных заболеваний и, в частности, в MN заболеваний5. Кислотные отсеки служат еще одним примером для внутренних органелл, которые движутся вдоль аксонов MN. Кислые отсеки включают в себя лисосомы, эндосомы, транс-голги аппарат, и некоторые секреторные пузырьки6. Дефекты в аксональной транспортировки кислых отсеков были обнаружены в нескольких нейродегенеративных заболеваний, а также7, и последние документы подчеркивают их важность в MN заболеваний8.
Для эффективного изучения аксонального транспорта часто используются микрофлюидные камеры, разделяющие соматические и аксональные,10отсеки. Два существенных преимущества микрофлюидной системы, а также разобщенности и изоляции аксонов, делают его идеальным для изучения субклеточных процессов11. Пространственное разделение между нейрональными клетками и аксонами может быть использовано для манипулирования внеклеточной средой различных нейрональных отсеков (например, аксонов против сомы). Биохимические, нейрональный рост / дегенерация, и иммунофлуоресценции анализы все выгоды от этой платформы. МФУ могут также помочь в изучении связи от клетки к клетке путем coculturing нейронов с другими типами клеток, таких как скелетные мышцы12,13,14.
Здесь мы описываем простой, но точный протокол для мониторинга митохондрий и кислого отсека транспорта в моторных нейронов. Мы также показываем использование этого метода, сравнивая относительный процент ретроградных и антероградных движущихся органелл, а также распределение транспортной скорости.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы описываем систему отслеживания аксонального переноса митохондрий и кислых отсеков в моторных нейронах. Эта упрощенная платформа in vitro позволяет точно контролировать, контролировать и манипулировать субклеточными нейронными отсеками, позволяя экспериментальный а…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Израильского научного фонда (ISF, 561/11) и Европейского исследовательского совета (ERC, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
- Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
- Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
- Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
- Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
- Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
- Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
- Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
- Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
- Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
- Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
- Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).
