Summary

Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van motorneuronen. In dit protocol bieden we een gedetailleerde methode voor het bijhouden van het axonale transport van zure compartimenten en mitochondriën in motorneuron axonen met behulp van microfluïdische kamers.

Abstract

Motorneuronen (MNs) zijn sterk gepolariseerde cellen met zeer lange axonen. Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van MN, bij te dragen aan neuronale groei, ontwikkeling en overleving. We beschrijven een gedetailleerde methode voor het gebruik van microfluïdische kamers (MPC’s) voor het bijhouden van axonal transport van fluorescerend gelabelde organellen in MN axons. Deze methode is snel, relatief goedkoop, en zorgt voor de monitoring van intracellulaire signalen in ruimte en tijd. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor: 1) Fabricage van polydimethylsiloxane (PDMS) MFP’s; 2) Plating van ventrale ruggenmergexplanten en MN gescheiden cultuur in MPC’s; 3) Etikettering van mitochondriën en zure compartimenten, gevolgd door live confocale verbeelding; 4) Handmatige en semi-geautomatiseerde axonale transportanalyse. Ten slotte tonen we een verschil aan in het transport van mitochondriën en zure compartimenten van HB9::GFP ventrale ruggenmerg explant axonen als een bewijs van de geldigheid van het systeem. Al met al biedt dit protocol een efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van het axonale transport van verschillende axonale componenten, evenals een vereenvoudigde handleiding voor MFC-gebruik om ruimtelijke experimentele mogelijkheden te helpen ontdekken.

Introduction

MNs zijn sterk gepolariseerde cellen met lange axonen, die tot een meter lang zijn bij volwassen mensen. Dit fenomeen vormt een cruciale uitdaging voor het onderhoud van MN-connectiviteit en -functie. Bijgevolg zijn MN’s afhankelijk van een goed transport van informatie, organellen en materialen langs de axonen van hun cellichaam naar de synaps en terug. Verschillende cellulaire componenten, zoals eiwitten, RNA en organellen worden regelmatig door de axonen geshuttled. Mitochondriën zijn belangrijke organellen die routinematig worden vervoerd in MNs. Mitochondriën zijn essentieel voor de juiste activiteit en functie van MN’s, verantwoordelijk voor ATP-voorziening, calciumbuffering en signaleringsprocessen1,2. Het axonale transport van mitochondriën is een goed bestudeerd proces3,4. Interessant is dat defecten in mitochondriaal transport betrokken waren bij verschillende neurodegeneratieve ziekten en specifiek bij MN-ziekten5. Zure compartimenten dienen als een ander voorbeeld voor intrinsieke organellen die langs MN axonen bewegen. Zure compartimenten zijn lysosomen, endosomen, trans-Golgi apparaat, en bepaalde secretoire blaasjes6. Gebreken in het axonale transport van zure compartimenten werden gevonden in verschillende neurodegeneratieve ziekten en7, en recente papers benadrukken hun belang in MN ziekten8.

Om axonaal transport efficiënt te bestuderen, worden microfluïdische kamers die somatische en axonale compartimenten scheiden vaak9,10gebruikt. De twee belangrijke voordelen van het microfluïdische systeem, en de compartimentering en de isolatie van axonen, maken het ideaal voor de studie van subcellulaire processen11. De ruimtelijke scheiding tussen de neuronale cellichamen en axonen kan worden gebruikt om de extracellulaire omgevingen van verschillende neuronale compartimenten te manipuleren (bijvoorbeeld axonen versus soma). Biochemische, neuronale groei/ degeneratie, en immunofluorescentie testen profiteren allemaal van dit platform. MPC’s kunnen ook helpen bij het bestuderen van cel-naar-cel communicatie door coculturing neuronen met andere celtypes, zoals skeletspieren12,13,14.

Hier beschrijven we een eenvoudig maar nauwkeurig protocol voor het monitoren van mitochondriën en zuur compartimenttransport in motorneuronen. We tonen verder het gebruik van deze methode door het relatieve percentage retrograde en anterograde bewegende organellen te vergelijken, evenals de verdeling van de transportsnelheid.

Protocol

De verzorging en behandeling van dieren in dit protocol werd uitgevoerd onder toezicht en goedkeuring van het Universiteitscomité voor dierethiek van Tel Aviv. 1. Voorbereiding van het MFC PDMS gieten in primaire mallen (Figuur 1) Koop of maak primaire mallen (wafers) volgens een gedetailleerd protocol9. Gebruik lucht onder druk om elk type vuil van het waferplatform te verwijderen voordat u overgaat tot de coa…

Representative Results

Volgens het beschreven protocol werden de embryonale HB9::GFP-ruggenmergexplanten gekweekt in MFC (figuur 4A). Explants werden gekweekt voor 7 dagen, toen axonen volledig gekruist in de distale compartiment. Mitotracker Deep Red en Lysotracker Rode kleurstoffen werden toegevoegd aan de distale en proximale compartimenten om de mitochondriën en zure compartimenten(figuur 4C)te labelen. Axonen in …

Discussion

In dit protocol beschrijven we een systeem om axonaltransport van mitochondriën en zure compartimenten in motorneuronen te volgen. Dit vereenvoudigde in vitro platform maakt nauwkeurige controle, monitoring en manipulatie van subcellulaire neuronale compartimenten mogelijk, waardoor experimentele analyse van lokale functies van motorneuron mogelijk is. Dit protocol kan nuttig zijn voor het bestuderen van MN-ziekten zoals ALS, om zich te concentreren op het begrijpen van het onderliggende mechanisme van axonale transport…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (ISF, 561/11) en de European Research Council (ERC, 309377).

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

References

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Play Video

Cite This Article
Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

View Video