Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO
Summary
Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.
Abstract
NEMO es una proteína de andamiaje que desempeña un papel esencial en la vía NF-B mediante el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. Tras la activación, el complejo IKK fosforila las moléculas de I-B que conducen a la translocación nuclear NF-B y a la activación de genes diana. La inhibición de la interacción NEMO/IKK es un paradigma terapéutico atractivo para la modulación de la actividad de la vía NF-B, haciendo de NEMO un objetivo para el diseño y el descubrimiento de inhibidores. Para facilitar el proceso de descubrimiento y optimización de los inhibidores NEMO, diseñamos una construcción mejorada del dominio de unión IKK de NEMO que permitiría la determinación de la estructura de la proteína en forma de apo y mientras se unía a inhibidores de peso molecular pequeño. Aquí presentamos la estrategia utilizada para el diseño, expresión y caracterización estructural del dominio de enlace IKK de NEMO. La proteína se expresa en células de E. coli, solubilizadas en condiciones de desnaturalización y purificadas a través de tres pasos cromatográficos. Discutimos los protocolos para la obtención de cristales para la determinación de la estructura y describimos las estrategias de adquisición y análisis de datos. Los protocolos encontrarán una amplia aplicabilidad a la determinación de la estructura de los complejos de NEMO y los inhibidores de moléculas pequeñas.
Introduction
La vía NF-B se activa en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, productos microbianos y estrés, para regular la expresión de genes diana responsables de la respuesta inflamatoria e inmunitaria, la muerte celular o la supervivencia y proliferación1. Patologías incluyendo enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer2,3,4,5 se han correlacionado con la hiperactivación de la vía, que ha hecho de la modulación de la actividad NF-B un objetivo principal para el desarrollo de nuevas terapias6,7.
La vía canónica NF-B, en particular, se distingue de la vía no canónica, responsable de la linfoorganogénesis y la activación de las células B, por la dependencia de la primera de la proteína de andamios NEMO (modulador esencial NF-B8) para el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. El complejo IKK es responsable de la fosforilación de I-B (inhibidor de la B) que se dirige a su degradación, liberando los dimers NF-B para translocar se translocando al núcleo para la transcripción génica1 y por lo tanto es un objetivo atractivo para el desarrollo de inhibidores para modular la actividad NF-B.
Nuestra investigación se centra en la caracterización de la interacción proteína-proteína entre NEMO e IKK, dirigida a NEMO para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de formación compleja IKK. El dominio de unión mínimo de NEMO, necesario para unir IKK, abarca los residuos 44-111, y su estructura se ha determinado en complejo con un péptido correspondiente a la secuencia 701-7459de IKK. NEMO e IKK forman un paquete de cuatro hélices donde el dimer NEMO acomoda los dos hélices de IKK(701-745) en una ranura abierta alargada con una interfaz de interacción extendida. IKK-(734-742), también conocido como el dominio de unión NEMO (NBD), define el punto caliente más importante para la unión, donde los dos triptófanos esenciales (739,741) entierran profundamente dentro del bolsillo nemo. Los detalles de la estructura compleja pueden ayudar en el diseño basado en la estructura y la optimización de pequeños inhibidores de moléculas dirigidos a NEMO. Al mismo tiempo, es difícil que la unión de una molécula pequeña o péptido recree en NEMO el cambio de conformación completo (es decir, la apertura extensiva del dimer de bobina enrollada NEMO) causada por la unión de la larga IKK(701-745), como se observa en el cristal, y la estructura de NEMO o NEMO unido a un inhibidor de molécula pequeña puede representar un mejor objetivo para el diseño de fármacos basados en la estructura y la optimización de inhibidores.
Nemo de longitud completa y construcciones de truncamiento más pequeñas que abarcan el dominio de unión IKK han demostrado ser intratables para la determinación de la estructura en la forma no enlazada a través de los métodos10de cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (NMR), lo que nos llevó a diseñar una versión mejorada del dominio de unión IKK de NEMO. De hecho, NEMO (44-111) en forma no enlazada sólo está parcialmente plegado y se somete a un intercambio conformación y, por lo tanto, nos fijamos para estabilizar su estructura dimerica, pliegue de bobina enrollada y estabilidad, preservando al mismo tiempo la afinidad de unión para IKK. Al anexar tres heptads de secuencias de bobinas enrolladas dimíricas ideales11 en el N-y C-termini de la proteína, y una serie de mutaciones de cuatro puntos, generamos NEMO-EEAA, una construcción totalmente dimerica y doblada en una bobina enrollada, que rescató la afinidad de unión IKK al rango nanomolar como se observó para la longitud completa de NEMO12. Como ventaja adicional, esperábamos que los adaptadores de bobina enrollada (basados en la secuencia GCN4) facilitarían la cristalización y eventualmente ayudarían en la determinación de la estructura de rayos X a través del reemplazo molecular. Los adaptadores de bobina enrollada se han utilizado de manera similar para aumentar la estabilidad, mejorar el comportamiento de la solución y facilitar la cristalización de bobinas recortadas y fragmentos de anticuerpos13,14. NEMO-EEAA se expresa y purifica fácilmente a partir de células de Escherichia. coli con una etiqueta de Histidina escleable, es soluble, doblado en una bobina de bobinado tenue estable y se cristaliza fácilmente, con difracción a 1,9o. La presencia de las regiones ordenadas de bobinas enrolladas de GCN4 podría ayudar adicionalmente a la eliminación gradual de los datos de los cristales de NEMO-EEAA mediante reemplazo molecular utilizando la estructura conocida de GCN415.
Dados los resultados obtenidos con apo-NEMO-EEAA, creemos que los protocolos descritos aquí también podrían aplicarse a la cristalización de NEMO-EEAA en presencia de pequeños péptidos (como el péptido NBD) o inhibidores de moléculas pequeñas, con el objetivo de comprender los requisitos para la inhibición de NEMO y la optimización basada en la estructura de los inhibidores iniciales de plomo a alta afinidad. Dada la plasticidad y la naturaleza dinámica de muchos dominios de bobina sin bobina16,el uso de los adaptadores de bobina enrollada podría encontrar una aplicabilidad más general para ayudar a la determinación estructural.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los intentos de cristalización de NEMO en forma no enlazada no tuvieron éxito, incluidos los intentos de usar la proteína de longitud completa y varias construcciones de truncamiento que abarcan el dominio de unión IKK. Nuestra caracterización biofísica del dominio iKK-unión de NEMO (residuos 44-111) por dicroísmo circular, espectroscopia de RMN y anisotropía de fluorescencia indicó que la construcción, aunque capaz de unir IKK, existía en un estado de intercambio conformación, no adecuado para la cristaliza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Profesor D. Madden, por muchas discusiones útiles a lo largo de este proyecto. Agradecemos al profesor D. Bolon por el regalo del plásmido que contiene la bobina enrollada GCN4 optimizada. Agradecemos al Dr. B. Guo por los plásmidos NEMO. Agradecemos a Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili y Amy E. Kennedy por demostrar el procedimiento. Agradecemos a la Instalación Básica de Cristalografía BioMT y a los departamentos de Química y De Bioquímica y Biología Celular de Dartmouth por el uso del equipo de cristalografía y el personal de BioMT por su apoyo. Esta investigación utilizó la línea de haz AMX de la National Synchrotron Light Source II, una Oficina de Usuarios de Ciencias del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) operada para la Oficina de Ciencia del DOE por el Laboratorio Nacional Brookhaven bajo el Contrato No. DE-SC0012704. Agradecemos al personal de NSLS II por su apoyo. Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 y P20GM113132, y una subvención Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
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