הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

מסלול NF-κB מופעל בתגובה מגוון של גירויים, כולל ציטוקינים, מוצרים מיקרוביאלית ומתח, כדי לווסת את הביטוי של גנים היעד האחראי תגובה דלקתית וחיסונית, מוות תאים או הישרדות והתפשטות¹. פתווגיות כולל מחלות דלקתיות ואוטואימוניות סרטן^2,3,4,5 היו מתואמים היפרהפעלה של השביל, אשר עשה אפנון של הפעילות NF-κB היעד העיקרי לפיתוח טיפולים חדשים^6,7.

הנתיב הקנוני-κB בפרט הוא נבדל מהשביל הלא קאנוני, האחראי על הפעלת lymphorganogenesis ו-cell, על ידי התלות של לשעבר על הפיגומים החלבון נמו (NF-κB essential מודולים⁸) עבור ההרכבה של הקומפלקס ikk עם IKKα ו IKKβ. מתחם ikk אחראי על זרחון של IκBα (מעכב של κB) כי מטרות זה עבור השפלה, שחרור NF-κB דימרים כדי לאתר את הגרעין עבור שעתוק גנים¹ ולכן הוא יעד אטרקטיבי לפיתוח מעכבי לווסת את NF-κB פעילות.

המחקר שלנו מתמקד באפיון של האינטראקציה חלבון-חלבון בין נמו ו IKKβ, מיקוד נמו לפיתוח מעכבי מולקולות קטנות של היווצרות מורכבות IKK. תחום מחייב מינימלי של נמו, נדרש לאגד IKKβ, כולל שאריות 44-111, והמבנה שלו נקבע מורכב עם פפטיד המתאים IKKβ רצף 701-745⁹. נמו ו IKKβ ליצור צרור ארבעה סליל שבו נמו דיימר להכיל שני הליקס של IKKβ (701-745) בחריץ פתוח מוארך עם ממשק אינטראקציה מורחבת. IKKβ (734-742), הידוע גם בשם התחום המחייב את נמו (NBD), מגדיר את המקום החם החשוב ביותר עבור הכריכה, שם שני טריפטוהנס החיוניים (739,741) לקבור עמוק בתוך הכיס נמו. הפרטים של המבנה המורכב יכול לסייע בעיצוב מבוסס מבנה ואופטימיזציה של מעכבי מולקולות קטנות מיקוד נמו. במקביל, קשה כי הקשירה של מולקולה קטנה או פפטיד יהיה ליצור מחדש ב-נמו השינוי המלא של הקונפורמציה (כלומר, פתיחה נרחבת של נמו מתפתל-סליל dimer) נגרמת על ידי איגוד של IKKβ ארוך (701-745), כפי שנצפה בגביש, ואת המבנה של נמו לא מאוגד או נמו מאוגד מולקולה קטנה מדכא עשוי לייצג יעד טוב יותר עבור מבנה מבוסס עיצוב הסמים ואופטימיזציה מעכב.

אורך מלא נמו ומבנים לחיתוך קטן המקיף את התחום כריכת IKK הוכיחו את הנחישות לקביעת מבנה בצורה לא מאוגד באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן ו תהודה מגנטית גרעינית (NMR) שיטות¹⁰, אשר מתבקש לנו לעצב גרסה משופרת של התחום המחייב IKK של נמו. אכן, נימו (44-111) בטופס הלא מאוגד הוא רק חלקית מקופל ועובר החליפין באופן חלקי, ולכן אנו מוגדר לייצב את המבנה הdimeric שלה, מתפתל סליל קיפול ויציבות, תוך שמירה על זיקה מחייבת IKKβ. על-ידי הוספת שלושה הפטנים של אידיאלי dimeric מתפתל-סליל רצפים¹¹ ב N-ו-C-termini של החלבון, וסדרה של ארבעה מוטציות הנקודה, יצרנו את נמו-EEAA, בונה באופן מלא dimeric מקופל בסליל מפותל, אשר הצילה את הזיקה ikk^-bindingלטווח nanomolar כפי שנצפתה כיתרון נוסף, קיווינו מתאמים מפותל סליל (מבוסס על רצף GCN4) יהיה להקל על התגבשות ובסופו של דבר לסייע בקביעת רנטגן מבנה באמצעות החלפת מולקולרית. מתאמים המתפתל-סליל מנוצל באופן דומה הן להגביר את היציבות, לשפר את התנהגות הפתרון ולהקל על התגבשות trimeric סלילי ושברי נוגדנים^13,14. נמו-EEAA מתבטאת בקלות ומטוהרים מ es, האבנצ’ה. התאים הcoli עם תגית Histidine ביקדין, הוא מסיסים, מקופל בסליל יציבה dimeric מתפתל והוא מגובש בקלות, עם עקיפה כדי 1.9 Å. הנוכחות של אזורים מתפתל מפותל סליל של GCN4 יכול בנוסף לסייע דיממו את הנתונים מקריסטלים של נמו-eeaa על ידי החלפת מולקולרית באמצעות המבנה הידוע של GCN4¹⁵.

בהינתן התוצאות שהתקבלו עם apo-נמו-EEAA, אנו מאמינים את הפרוטוקולים המתוארים כאן יכול גם להיות מיושם על התגבשות של נמו-EEAA בנוכחות של פפטידים קטנים (כמו פפטיד d המולקולה) או מעכבי מולקולה קטנה, עם המטרה של הבנת הדרישות של נמו עיכוב מבנה מבוסס אופטימיזציה של מעכבי עופרת הראשונית בהינתן הפלסטיות והאופי הדינמי של מספר רב^{של מבני מתחם}הסליל המתפתל, השימוש במתאמים המתפתל מתפתל יכול למצוא ישימות כללית יותר בסיוע להגדרה מבנית.