Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO
Summary
Nous décrivons des protocoles pour la détermination de structure du domaine IKK-contraignant de NEMO par la cristallographie de rayon X. Les méthodes incluent l’expression, la purification et la caractérisation des protéines ainsi que des stratégies pour une optimisation réussie des cristaux et la détermination de la structure de la protéine sous sa forme non liée.
Abstract
NEMO est une protéine d’échafaudage qui joue un rôle essentiel dans la voie NF-B en assemblant le complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Lors de l’activation, le complexe IKK phosphorylate les molécules i-B conduisant à la translocation nucléaire NF-B et à l’activation des gènes cibles. L’inhibition de l’interaction NEMO/IKK est un paradigme thérapeutique attrayant pour la modulation de l’activité de la voie NF-B, faisant de NEMO une cible pour la conception et la découverte d’inhibiteurs. Pour faciliter le processus de découverte et d’optimisation des inhibiteurs NEMO, nous avons conçu une construction améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO qui permettrait la détermination de la structure de la protéine sous forme d’apo et tout en se liant à de petits inhibiteurs du poids moléculaire. Ici, nous présentons la stratégie utilisée pour la conception, l’expression et la caractérisation structurelle du domaine IKK-contraignant de NEMO. La protéine est exprimée dans les cellules E. coli, solubilisée dans des conditions dénaturantes et purifiée par trois étapes chromatographiques. Nous discutons des protocoles pour l’obtention de cristaux pour la détermination de la structure et décrions les stratégies d’acquisition et d’analyse des données. Les protocoles trouveront une large applicabilité à la détermination de la structure des complexes de NEMO et des inhibiteurs de petites molécules.
Introduction
La voie NF-B est activée en réponse à une variété de stimuli, y compris les cytokines, les produits microbiens et le stress, pour réguler l’expression des gènes cibles responsables de la réponse inflammatoire et immunitaire, la mort cellulaire ou la survie et la prolifération1. Les pathologies, y compris les maladies inflammatoires et auto-immunes et le cancer2,3,4,5 ont été corrélées à l’hyperactivation de la voie, qui a fait de la modulation de l’activité NF-B une cible de choix pour le développement de nouvelles thérapies6,7.
La voie canonique NF-B en particulier se distingue de la voie non canonique, responsable de la lymphorganogenèse et de l’activation des cellules B, par la dépendance de l’ancien à la protéine d’échafaudage NEMO (modulateur essentiel NF-B8) pour l’assemblage du complexe IKK avec les kinases IKKet et IKK. Le complexe IKK est responsable de la phosphorylation de l’IB (inhibiteur de l’IB) qui le cible pour la dégradation, libérant les dieux NF-B pour se translocaliser au noyau pour la transcription génique1 et est donc une cible attrayante pour le développement d’inhibiteurs pour moduler l’activité NF-B.
Notre recherche se concentre sur la caractérisation de l’interaction protéine-protéine entre NEMO et IKKMD, ciblant NEMO pour le développement de petites molécules inhibitrices de la formation complexe IKK. Le domaine de liaison minimal de NEMO, requis pour lier IKKMD, englobe les résidus 44-111, et sa structure a été déterminée en complexe avec un peptide correspondant à la séquence IKKMD 701-7459. NEMO et IKKMD forment un faisceau de quatre hélices où le dimère NEMO accueille les deux helices d’IKKMD(701-745) dans une rainure ouverte allongée avec une interface d’interaction étendue. IKK(734-742), également connu sous le nom de domaine neMO-contraignant (NBD), définit le point chaud le plus important pour la liaison, où les deux tryptophanes essentiels (739 741) enterrent profondément dans la poche NEMO. Les détails de la structure complexe peuvent aider à la conception et à l’optimisation de la structure des inhibiteurs de petites molécules ciblant NEMO. Dans le même temps, il est difficile que la liaison d’une petite molécule ou d’un peptide recrée dans NEMO le changement conformationnel complet (c.-à-d., ouverture étendue du dimère enroulé-enroulé NEMO) causé par la liaison du long IKKMD(701-745), comme on l’observe dans le cristal, et la structure de NEMO ou NEMO non lié à un inhibiteur de petite molécule peut représenter une meilleure cible pour la conception et l’inhibition de la conception et de l’inhibition des médicaments basés sur la structure.
La pleine longueur NEMO et les constructions de truncation plus petites englobant le domaine IKK-contraignant se sont avérées insolubles pour la détermination de structure dans la forme non liée par l’intermédiaire de la cristallographie de rayon X et des méthodes de résonance magnétique nucléaire (NMR)10,qui nous a incités à concevoir une version améliorée du domaine IKK-contraignant de NEMO. En effet, NEMO (44-111) sous la forme non liée n’est que partiellement plié et subit un échange conformationnel et nous nous sommes donc mis à stabiliser sa structure dimérique, pli de bobine enroulée et la stabilité, tout en préservant l’affinité de liaison pour IKK. En émettant trois heptades de séquences idéales de bobines sombres11 au n et C-termini de la protéine, et une série de mutations à quatre points, nous avons généré NEMO-EEAA, une construction entièrement dimérique et pliée dans une bobine enroulée, qui a sauvé l’affinité IKK-liaison à la gamme nanomolar comme observé pour la pleine longueur NEMO12. Comme avantage supplémentaire, nous espérions que les adaptateurs enroulés (basés sur la séquence GCN4) faciliteraient la cristallisation et, éventuellement, faciliteraient la détermination de la structure des rayons X par le remplacement moléculaire. Les adaptateurs enroulés ont été utilisés de la même façon pour augmenter la stabilité, améliorer le comportement de la solution et faciliter la cristallisation des bobines et des fragments d’anticorps trimmériques13,14. NEMO-EEAA est facilement exprimé et purifié à partir des cellules Escherichia. coli avec une étiquette cléavable Histidine, est soluble, plié dans une bobine faible stable enroulée et est facilement cristallisé, avec une diffraction à 1,9 . La présence des régions à bobines commandées de GCN4 pourrait en outre aider à l’apaisement des données des cristaux de NEMO-EEAA par remplacement moléculaire en utilisant la structure connue de GCN415.
Compte tenu des résultats obtenus avec apo-NEMO-EEAA, nous croyons que les protocoles décrits ici pourraient également être appliqués à la cristallisation de NEMO-EEAA en présence de petits peptides (comme le peptide NBD) ou d’inhibiteurs de petites molécules, dans le but de comprendre les exigences pour l’inhibition de NEMO et l’optimisation basée sur la structure des inhibiteurs initiaux de plomb à une affinité élevée. Étant donné la plasticité et la nature dynamique de nombreux domaines enroulés16, l’utilisation des adaptateurs enroulés pourrait trouver une applicabilité plus générale pour faciliter la détermination structurelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les tentatives de cristallisation de NEMO sous la forme non liée ont échoué, y compris des tentatives utilisant la protéine pleine longueur et plusieurs constructions de truncation englobant le domaine iKK-contraignant. Notre caractérisation biophysique du domaine iKK-contraignant de NEMO (résidus 44-111) par dichroisme circulaire, spectroscopie RmN et anisotropy de fluorescence a indiqué que la construction, bien que capable de lier IKK, existait dans un état d’échange conformationnel, ne convient pas à la cri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le professeur D. Madden pour les nombreuses discussions utiles qui ont eu lieu tout au long de ce projet. Nous remercions le professeur D. Bolon pour le don du plasmide contenant la bobine optimisée GCN4 enroulée. Nous remercions le Dr B. Guo pour les plasmides NEMO. Nous remercions Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili et Amy E. Kennedy d’avoir démontré la procédure. Nous remercions l’installation de base de cristallographie BioMT et les départements de chimie et de biochimie et de biologie cellulaire de Dartmouth pour l’utilisation de l’équipement de cristallographie et du personnel de BioMT pour leur soutien. Cette recherche a utilisé la ligne de faisceau AMX du National Synchrotron Light Source II, un Office of Science User Facility du département de l’Énergie des États-Unis exploité pour le DOE Office of Science par le Brookhaven National Laboratory en vertu du contrat no. DE-SC0012704. Nous remercions le personnel de NSLS II pour son soutien. Ces travaux ont été financés par les subventions des NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 et P20GM113132, ainsi qu’une subvention Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
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