Производство, кристаллизация и структурное определение мкножеского домена NEMO, имеющего обязательную силу IKK

Путь НФ-ЗБ активируется в ответ на различные стимулы, включая цитокины, микробные продукты и стресс, для регулирования экспрессии генов-мишеней, ответственных за воспалительный и иммунный ответ, гибель клеток или выживание и пролиферацию¹. Патологии, включая воспалительные и аутоиммунные заболевания и рак^2,3,4,5 были коррелированы с гиперактивацией пути, что сделало модуляцию деятельности NF-QB основной мишенью для разработки новых методов лечения^6,7.

Канонический путь NF-QB, в частности, отличается от неканонического пути, ответственного за лимфорганогенез и активацию В-клеток, зависимостью первого от леса белка NEMO (NF-QB основной модулятор⁸) для сборки IKK-комплекса с кининами IKK и IKK. Комплекс IKK отвечает за фосфорилирование ИЗБЗ (ингибитор ЗВ), который нацелен на деградацию, освобождая димеры NF-qB для перемещения в ядро для транскрипции^{генов 1} ЗЗ и, следовательно, является привлекательной мишенью для развития ингибиторов для модулирования активности NF-B.

Наше исследование фокусируется на характеристике белково-белкового взаимодействия между NEMO и IKK, ориентированной на NEMO для разработки малых молекул ингибиторов формирования комплекса IKK. Минимальная связывающая область NEMO, необходимая для связывания ИККЗ, включает в себя остатки 44-111, и его структура была определена в комплексе с пептидом, соответствующим последовательности IKK 701-745⁹. NEMO и IKK’ образуют четырехсепарок, где NEMO dimer вмещает два сипов IKK (701-745) в удлиненный открытый паз с расширенным интерфейсом взаимодействия. IkK (734-742), также известный как NEMO-обязательный домен (NBD), определяет наиболее важную горячую точку для связывания, где два основных триптофанов (739 741) хоронят глубоко в кармане NEMO. Детали сложной структуры могут помочь в структуре на основе проектирования и оптимизации малых ингибиторов молекулы ориентации NEMO. В то же время, трудно, что связывание небольшой молекулы или пептида воссоздало бы в NEMO полное конформивное изменение (т.е. обширное открытие dimer с коритой сутышки NEMO), вызванное связыванием длинной IKK (701-745), как наблюдается в кристалле, и структура несвязанной NEMO или NEMO, связанной с небольшим ингибитором молекулы, может представлять собой лучшую структуру ингибирования.

Полноформатные NEMO и более мелкие конструкции усечения, охватывающие область IKK-связывания, оказались неразрешимыми для определения структуры в несвязанной форме с помощью рентгеновской кристаллографии и методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР)¹⁰, что побудило нас разработать улучшенную версию обязательной области NEMO. Действительно, NEMO (44-111) в несвязанной форме лишь частично сложен и претерпевает конформационный обмен, и поэтому мы намерены стабилизировать его димерную структуру, складку свернутой катушки и стабильность, сохраняя при этом связывающее сродство к IkK. Путем связывать 3 heptads идеально dimeric coiled-coil последовательностей¹¹ на N-и C-termini протеина, и серии 4 перегласовок пункта, мы произвели NEMO-EEAA, конструкцию полно dimeric и сложенную в свернутой катушке, которая спасла IKK-связывающе сродство к наномолярному диапазону как наблюдаемое для полной длины NEMO¹². В качестве дополнительного преимущества мы надеялись, что адаптеры с кудрявых катушек (на основе последовательности GCN4) облегчат кристаллизацию и в конечном итоге помогут в определении структуры рентгеновского излучения с помощью молекулярной замены. Сонючие катушка адаптеры были аналогичным образом использованы как для повышения стабильности, улучшить поведение решения и облегчить кристаллизацию для тримерных скудных катушек и фрагментов антител^13,14. NEMO-EEAA легко выражается и очищается от клеток Escherichia. coli с размытым тегом гистидина, растворяется, сложен в стабильную тусклую свернутую катушки и легко кристаллизуется, с дифракцией до 1,9 евро. Наличие упорядоченных спиральных катушек регионов GCN4 может дополнительно помочь в постепенном использовании данных из кристаллов NEMO-EEAA путем молекулярной замены с использованием известной структуры GCN4¹⁵.

Учитывая результаты, полученные с apo-NEMO-EEAA, мы считаем, что описанные здесь протоколы также могут быть применены к кристаллизации NEMO-EEAA в присутствии небольших пептидов (например, пептида NBD) или малых ингибиторов молекулы, с целью понимания требований к ингибированию NEMO и структурной оптимизации первоначальных ингибиторов свинца к высокой сродости. Учитывая пластичность и динамичный характер многих доменов скудной катушки^16,использование смоченной катушки адаптеры могли бы найти более общую применимость в оказании помощи структурного определения.