NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

NF-κB経路は、サイトカイン、微生物産物およびストレスを含む様々な刺激に応答して活性化され、炎症および免疫応答を担う標的遺伝子の発現を調節し、細胞死または生存および増殖¹を担う。炎症性および自己免疫疾患および癌^{2、3、4、5を}含む病理は、経路の過活性化と相関しており、これはNF−κB活性の変調を新しい治療法^の開発のための主要な標的としている^6、7である。

特に正規のNF-κB経路は、非正規経路と区別され、リンパ有機生起とB細胞活性化を担い、前者の足場タンパク質NEMO(NF-κB必須変調器⁸⁾への依存によって、キナーゼIKKαおよびIKKβを有するIKK複合体の集合体に対する。IKK複合体は、分解を標的とするIκBα(κBの阻害剤)のリン酸化を担い、遺伝子転写¹の核に転移するNF-κBダイマーを解放し、したがってNF-κB活性を調節する阻害剤の開発のための魅力的な標的である。

本研究では、NeMOとIKKβの間のタンパク質間相互作用の特性評価に焦点を当て、IKK複合体形成の低分子阻害剤の開発に向けたNEMOを標的としています。NEMOの最小結合ドメインは、IKKβを結合するために必要とされ、残基44〜111を包含し、その構造は、IKKβ配列701〜7459に対応するペプチドと複合体で決定されている。NEMOとIKKβは、NEMOダイマーが拡張相互作用インタフェースを備えた細長い開いた溝にIKKβ(701-745)の2つのヘリックスを収容する4ヘリックスバンドルを形成します。IKKβ(734-742)はNEMO結合ドメイン(NBD)とも呼ばれ、2つの必須トリプトファン(739,741)がNEMOポケット内に深く埋め込まれる結合のための最も重要なホットスポットを定義します。複雑な構造の詳細は、NEMOを標的とする低分子阻害剤の構造ベースの設計と最適化に役立ちます。同時に、小分子またはペプチドの結合が、結晶中に観察されるように、長いIKKβ(701-745)の結合によって引き起こされる完全な立体構造変化(すなわち、NEMOコイルコイルダイマーの広範な開口部)をNEMOで再現することは困難であり、そして、低分子阻害剤に結合した非結合NEMOまたはNEMOの構造は、より良い標的を表し得る。

IKK結合ドメインを包含する全長NEMOおよび小型切り捨てコンストラクトは、X線結晶学および核磁気共鳴(NMR)法¹⁰を介した非結合形態の構造決定に対して難解であることが証明されており、NEMOのIKK結合ドメインの改良版を設計するよう促した。実際、非結合形態のNEMO(44-111)は部分的に折り畳まれ、立体構造交換を受けるので、IKKβの結合親和性を保ちながら、その二量体構造、コイルコイルの折り畳み、安定性を安定させる設定を行っています。タンパク質のN-およびC末端に理想的な二量体コイルコイルシーケンス¹¹の3つのヘプタドを加え、一連の4点突然変異を加えることで、完全に二量体化された構造であるNEMO-EEAAを生成し、コイル状のコイルに折り畳まれ、全長^NEMO12で観察されたナノモル範囲に対するIKK結合親和性を検出した。さらなる利点として、コイルコイルアダプタ(GCN4シーケンスに基づく)が結晶化を促進し、最終的には分子置換によるX線構造決定に役立つことを期待しました。コイルコイルアダプタは、安定性を高め、溶液挙動を改善し、三量体コイルおよび抗体断片^13、14に対する結晶化を促進するために同様に利用されている。NEMO-EEAAは、クリーバ可能なヒスチジンタグを有する大腸菌細胞から容易に発現および精製され、可溶性であり、安定した二量体コイルコイルに折り畳まれ、1.9Åへの回折で容易に結晶化される。GCN4の順序付けられたコイルコイル領域の存在は、GCN4¹⁵の既知の構造を用いた分子置換によるNEMO-EEAAの結晶からのデータのフェージングをさらに助けることができる。

アポ-NEMO-EEAAで得られた結果を考えると、ここで説明するプロトコルは、NEMO阻害の要件を理解し、初期リード阻害剤の構造ベースの最適化を高い親和性に理解することを目的として、小型ペプチド(NBDペプチドなど)または低分子阻害剤の存在下でNEMO-EEAAの結晶化にも適用できると考えています。多くのコイルコイルドメイン¹⁶の可塑性および動的性質を考えると、コイルコイルアダプタの使用は、構造決定を支援する上でより一般的な適用性を見つけることができる。