Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

Infecção com base em modelos experimentais são inerentemente desafiadoras devido a sua dependência sobre as condições de estado inicial do hospedeiro e patógeno, as várias estratégias de infecção do patógeno e a dificuldade de atribuir o patógeno e hospedeiro-orientado a processos com base em resultados. A bactéria Listeria monocytogenes (Lm) tornou-se um patógeno ideal para sondar as respostas de defesa do hospedeiro por causa de sua rastreabilidade genética e microbiológica, sua estratégia de infecção celular rápida e processive e relativamente clara relação entre seus fenótipos de infecção celular e organísmica-nível. A infecção celular de Lm procede por quatro fases distintas¹: (i) invasão celular que conclui com Lm sendo colocadas dentro de um vacúolo; (ii) Lm-dirigido a dissolução da membrana do vacúolo e libertação de Lm no citosol; (iii) intracytosolic replicação; e (iv) penetração física da membrana plasmática que resulta na infecção de células diretamente adjacentes (tais como uma folha epitelial) ou, em celas solitárias, lançamento do Lm para o meio extracelular. Cada uma destas fases são promovidos pelo específico Lm-codificado fatores (referidos como 'fatores de virulência') que, quando eliminado, causar defeitos de infecção em modelos celulares e animais. Esta estratégia de infecção geral tem sido evoluiu de modo independente por vários dos chamados patógenos 'citosólica'².

Formadoras de Colônia (UFC) de unidade ensaios são amplamente empregados para avaliar ambos in vitro (ou seja, celulares), bem como in vivo (ou seja, organísmica) resultados de infecção. Além de sua alta sensibilidade, particularmente para infecções em vivo, CFU ensaios fornecem uma leitura ambígua para invasão do patógeno e sobrevivência/proliferação intracelular. CFU ensaios têm sido utilizados extensivamente para analisar os determinantes de célula Lm e o anfitrião que impactam a infecção. Tão informativa como estes estudos prévios foram analisar a invasão celular e replicação de intracytosolic, ensaios de UFC não, o melhor de nosso conhecimento, foram utilizados para acompanhar a quarta fase do processo de infecção de Lm : fuga de celular. Aqui, descrevemos relativamente simples meios de evacuação como celular (doravante referida como 'emergência') podem ser monitorados por meio de ensaio CFU (bem como por citometria de fluxo) e mostrar exemplos de como os dois fatores do patógeno e hospedeiro codificado - regulam esta fase da Lm ciclo de infecção. A análise da fase terminal do ciclo celular Lm infecção pode tornar possível identificar atividades e fatores de infecção específica de célula do hospedeiro e patógeno adicional.

Os ratos foram tratados com humanidade em conformidade com todas as directrizes do governo apropriado para o cuidado e uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde e seu uso foi aprovados para este estudo todo pelo cuidado Animal institucional Universidade de Miami e o Comitê de uso (protocolo 16-053).

1. preparar células para a infecção

1. Propagar o rato macrófago-como a linha celular 264.7 crus em meios de cultura de tecido DMEM suplementados com 10% de soro fetal bezerro (doravante referido como DMEM/FCS) usando um balão de 125 mL e uma incubadora de cultura de tecidos, mantida a 37 °C/5% CO₂.
2. O dia antes da infecção, use uma espátula de célula para remover células de balão de expansão e recolher em um tubo cônico de 15 mL tampa de rosca. Células em 800 x g durante 10 minutos de centrifugação, decante o sobrenadante e suspender o centrifugado em 1 mL de DMEM/FCS (sem antibióticos) e determinar o título usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
3. Ajustar a concentração de 2 x 10⁶ células/mL e adicionar 0,10 mL (2 x 10⁵ células) para poços de uma placa de cultura de tecido 48-bem. Certifique-se de que a suspensão de eritrócitos cobre toda a superfície do poço.
   1. Células de placa em poços adicionais para uma posterior fonte de mídia condicionadas. Também coloca 0,10 mL de DMEM/FCS em três poços adicionais para servir como um 'nenhuma célula controle'.
4. Incube durante uma noite em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 °C/5% CO₂. No dia seguinte, não retire da incubadora até o inóculo da bactéria é preparado e pronto para uso.

2. preparação de Listeria monocytogenes (Lm) para infecção

1. Inocular a 2 mL de infusão de cérebro-coração (BHI) com uma única colônia de uma placa de ágar recém leucostictus (< 2 dias) da Lm e incubar durante uma noite a 37 ° C, com agitação em 130 rotações/min.
2. No dia seguinte, adicione 0,10 mL de cultura durante a noite para 2ml pré aquecido BHI e continuar a incubar a 37 ° C, com agitação até que a densidade óptica (OD₆₀₀) é entre 0,4 e 0,6.
3. Determine aproximada concentração bacteriana usando uma fórmula de conversão derivados empiricamente. Em nosso laboratório, uma cultura de Lm exponencialmente crescente em BHI é aproximadamente 1.3 x 10⁹ formadoras de unidades (CFU) / OD₆₀₀. Minimize a quantidade de tempo que culturas bacterianas são expostas à temperatura ambiente.
4. Apenas antes da infecção, ajuste a concentração de 5 x 10⁷ UFC/mL, usando pré-aquecido DMEM/FCS como diluente.

3. infecção

1. Trabalhar rapidamente e precisamente, adicionar 20 µ l (1 x 10⁶ UFC; multiplicidade de infecção, MOI = 5) do inóculo a Lm recém-preparado (passo 2.4 acima) para poços inclinando ligeiramente o prato e cuidadosamente, colocando a ponta da pipeta na mídia sobrejacente;
   Nota: Evite tocar as paredes do poço com a ponta da pipeta.
2. Delicadamente pipetar o conteúdo de cada poço para garantir completa a mistura; Não sacuda ou significativamente incline o prato como isso vai se espalhar por Lm as paredes do poço. Retorne o prato de cultura celular para 37 °C/5% CO₂ incubadora.
3. Prepare uma solução de gentamicina 10 µ g/mL usando mídia condicionadas de poços não infectados como diluente.
4. Em 30 minutos pós infecção (mpi), cuidadosamente Adicionar 30 µ l da solução de gentamicina (concentração final 2,5 µ g/mL) e suavemente pipetar o conteúdo do bem como antes e placa de cultura de célula retorno a 37 °C/5% CO₂ incubadora.
5. Em 60 mpi, colheita poços apropriados para ensaio CFU (60 mpi ponto de tempo) ou análise FCM (como descrito abaixo nas secções 4 e 5, respectivamente).
6. Para poços restantes, em vários momentos depois ou colher células como antes, ou, para o ensaio de surgimento de Lm , inteiramente remover mídia do poço e substituir com 150 µ l de mídia condicionada livre de gentamicina.

4. amostragem, processamento e análise de intracelular e emergente Lm por ensaio CFU

1. A colheita, incline ligeiramente o prato e remova cuidadosamente a mídia inteira do poço. Adicione a 0,50 mL de água destilada estéril (dsH₂O) para o poço. Após 30 s, transferir a água resultante lisada (10⁰) para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e vórtice vigorosamente por 10 s.
2. Prepare-se 10^-1 e 10^-2 diluições adicionando ou 4,5 µ l ou 50 µ l de água lisada a 450 µ l de dsH₂O e brevemente vórtice para assegurar uma mistura completa.
3. Espalhe 50 µ l de 10 a⁰, 10^-1 e/ou 10 amostras de^-2 em placas de ágar lisogenia caldo (LB).
4. Ensaio para emergentes Lm (passo 3.6 acima), remover 10 µ l da mídia sobreposição e dividi-lo em alíquotas de 2 a 5 µ l: a uma alíquota adicionar 5 µ l de DMEM/FCS e a segunda alíquota adicionar 5 µ l de DMEM/FCS contendo 5 gentamicina µ g/mL. Controle o último distingue entre extracelular Lm (gentamicina sensível) e do ensaio intracelular Lm (gentamicina resistente) no CFU subsequente.
5. Depois de 5 min à temperatura ambiente, adicione 90 µ l de dsH₂O, vortex vigorosamente durante 10 s e propagação 50 µ l em placas de ágar LB.
6. Enumerar a Lm colônias em placas de ágar LB após 2 dias de incubação a 37 ° C.

5. amostragem, processamento e análise de intracelular e emergente Lm por citometria de fluxo (FCM)

1. Prepare 264.7 pilhas conforme descrito nos passos 1.1-4. Ajustar as células a 1 x 10⁶ células/mL e adicionar 1 mL (1 x 10⁶ células) para poços de uma placa de cultura de tecido 6-poços.
2. Preparar o inóculo da bactéria, conforme descrito no passo 2.1-2.3 e infectar células com volume de inóculo, correspondente a um MOI de 50 (5 x 10⁷ UFC).
3. A infecção de post de 1,5 horas (hpi), coletar mídia do primeiro conjunto de poços e coloque em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL com 500 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) e lugar no gelo até que todos os poços foram processados.
4. Para coletar intracelular Lm, adicione 1 mL de dsH₂O para o poço e depois de 60 s, transfira a lisado de água resultante para um tubo de microcentrifuga de 1,5 mL com 500 µ l de 4% PFA. Vórtice vigorosamente durante 10 s e lugar no gelo até que todos os poços foram processados. (Processamento de amostra é descrito na etapa 5.8 abaixo).
5. Para poços restantes, remova a mídia e substituir com 1 mL de DMEM/FCS com 5 gentamicina µ g/mL para matar extracelular Lm e devolver imediatamente as células para incubadora.
6. Depois de 30 min (2 hpi) remover mídia e substituir com DMEM/FCS sem gentamicina.
7. Após 2 e 4 h (hpi 4 e 6) tomar a segunda e a terceira vez pontos através da recolha de meios de comunicação e lisados como etapas 5.3 e 5.4.
8. Centrifugar tubos a 10.000 x g durante 7 min. remover sobrenadante sem perturbador da pelota.
9. Suspender a cada pellet de coloração, o cocktail de 50 µ l de 4% PFA e 15 µ l de faloidina. Incube os tubos no escuro a 4 ° C por 20 min.
10. Após a incubação adicione 1 mL de tampão de FACS a cada tubo e pipeta para cima e para baixo se misturam.
11. Gire os tubos a 10.000 x g durante 7 min. remover sobrenadante sem perturbador da pelota.
12. Suspender a cada pellet em 400 µ l de tampão de FACS para uso imediato, ou 200 µ l de tampão de FACS e 200 µ l de 4% PFA se armazenando para análise posterior.
13. Executar amostras em uma citometria de fluxo e analisar os dados coletados.

6. amostragem, processamento e análise de colonização Lm e respostas de Host no fígado

1. Prepare o Lm para infecção, conforme descrito no passo 2.1-2.3.
2. Calcule a quantidade necessária de subcultura para desejado título de 3 x 10⁶ UFC/mL.
3. Apenas antes da infecção, dilua a quantidade de bactérias calculadas com pré-aquecido Hank está equilibrado sal solução (HBSS) em um volume final de 1 mL. Este é o inóculo de entrada que é injetado o mouse.
4. Utilizando uma seringa de insulina 100U G½ 28, desenhar 100 µ l (3 x 10⁵ UFC) de inóculo entrado e remover quaisquer bolhas de ar visível.
5. Coloque o mouse (linhagem C57BL/6; os machos entre 6 e 12 semanas de idade) em apoio de exploração e utilizar água quente (não mais do que 45 ° C) para dilatar a veia da cauda e, em seguida, injetar o inóculo de entrada para a veia.
6. 10^-2 e 10^-3 diluições do inóculo entrada nas chapas de 10bcm LB ágar da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C para determinar a dose de entrada real.
7. Em 18 hpi, humanamente eutanásia mouse (CO₂ asfixia seguida por deslocamento cervical) e usando o peritônio do mouse abrir corte de tesoura estéril para coletar o lóbulo frontal do fígado usando pares separados de pinças e tesouras para fora e dentro de o mouse. Coloque o fígado em um prato de Petri no gelo de 6cm.
8. Corte o fígado em cubos pequenos e coloque num frasco de vidro com uma barra de agitação magnética. Adicione 2 mL de colagenase 2 mg/mL D reconstituído em DMEM sem FCS. Incube frascos a 37 ° C em um agitador magnético para min 30−45. Uma vez que o tecido é homogeneizado, adicione 3 mL de DMEM/FCS para inactivar a colagenase.
9. Filtre as células através de um filtro de célula de 70 µm para um tubo cônico, adicionando mais DMEM/FCS, se necessário.
10. Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C por 10 min de Pelotas, remover o sobrenadante e suspender centrifugado em 500 µ l de tampão ACK para lisar células vermelhas do sangue.
11. Incube as células à temperatura ambiente por 5 min em buffer ACK. Suspenda as células em 1 mL de DMEM/FCS.
12. Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C por 10 min de Pelotas, remover o sobrenadante e suspender em 1 mL de DMEM/FCS. Em seguida, conte as células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada.
13. Transferi 1 x 10⁶ células para tubo de 1,5 mL microcentrifuga e girar a bola. Então suspenda em 1 mL de dsH₂O vórtice para lisar as células. 50 µ l em placas LB no não diluído e 10^-2 diluições da placa e incubar a 37 ° C para enumerar Lm para análise do UFC.
14. Transferir 1 x 10⁶ células para tubos de FACS para cada amostra de tecido de acordo com a contagem de células e lavar com 1 mL de tampão de FACS.
15. Centrifugar as células a 800 x g a 4 ° C por 10 min de pelotas e remover o sobrenadante.
16. Prepare um coquetel de anticorpos que contém os anticorpos de interesse com base na concentração recomendada para cada anticorpo e buffer de FACS. Consulte Tabela de materiais para quantidades recomendadas utilizadas na análise.
17. Suspender o sedimento em 100 µ l de anticorpo cocktail e incubar os tubos no escuro a 4 ° C por 30 min.
18. Após a incubação, adicionar 2 mL de tampão de FACS a cada tubo e suspender as células.
19. Centrifugar as células em 800 x g a 4 ° C de pelotas e descartar o sobrenadante. Então, suspender o sedimento em 400 µ l de tampão de FACS para uso imediato, ou 200 µ l de tampão de FACS e 200 µ l de 4% PFA se guardar para mais tarde.
20. Analisar as células por citometria de fluxo (consulte a etapa 5.13).

Avaliar o papel do patógeno e hospedeiro-codificado fatores impactando infecção celular
Usando as condições de infecção descritas acima, 0,15% da entrada do selvagem-tipo Lm é recuperado após 1,5 h de incubação co com macrófagos cultivados (Figura 1A). No subsequente 1,5 h de incubação co (3h pós infecção, hpi), houve um 4-fold aumento na recuperação de viável Lm e de 3 a 6 hpi, houve um aumento de 7.5-fold adicional na recuperação de viável Lm. Desde que o antibiótico gentamicina célula-impermeável é adicionado às culturas co em 1 hpi para eliminar extracelular Lm, o 30-fold aumento nos níveis de Lm viáveis entre 1,5 e 6 hpi exclusivamente representa proliferação intracelular.

LM acede rapidamente para o citosol seguindo sua internalização dentro das células eucarióticas (ver introdução). Citosólico Lm associa-se a máquinas de polimerização de actina por quais meios ele se capaz de penetrar a membrana plasmática impulsiona. No ensaio in vitro de infecção descritas acima, se a gentamicina é removida dos poços no hpi 6, extracelular Lm pode ser facilmente detectado 1h mais tarde (7 hpi) na mídia sobrejacente (Figura 1B). Não CFUs foram recuperados dos poços de controle que não foram semeadas com macrófagos, mas que outra forma foram tratados de forma idêntica como poços semeados, assim, mostrando que a aparência do extracelular Lm era totalmente dependente da presença de macrófagos e Não é um resultado de incompleto matar antibiótico (não mostrado).

A capacidade de Lm para sobreviver e proliferar intracelular é largamente dependente de um conjunto de genes cuja expressão são controlados pelo factor de transcrição fator regulador positivo um (PrfA)¹. Inicialmente, há uma recuperação comparável da estirpe selvagem-tipo Lm e uma estirpe mutante de Lm , excluído para este fator (ΔprfA) (Figura 1A). No entanto, há uma consequente redução na recuperação da estirpe ΔprfA após incubação prolongada de co, tal que a recuperação no hpi 6 é 3 vezes menor do que a recuperação em 1,5 hpi. Modo e conforme esperado, as bactérias deprfA Δ não foram detectadas na mídia sobrejacente às 7 hpi (Figura 1B).

A atividade de PrfA é regulada em vários níveis. Um número de variantes de PrfA constitutivamente ativos, codificada pelo hipervirulento prfA * alelos, foram isolados³. Uma tensão de Lm , possuindo um prfA * tem um perfil de infecção inicial, que é comparável da estirpe selvagem-tipo isogénicas de 1,5 e 3 hpi (Figura 1A). No entanto, entre 3 e 6 hpi, o dobra-aumento da estirpe prfA * significativamente diferia do que da estirpe selvagem-tipo. Novamente, modo e conforme esperado, a tensão prfA * prontamente foi detectada na mídia sobrejacente às 7 hpi em níveis significativamente superiores que observado para a cepa de Lm do selvagem-tipo (Figura 1B).

Após seu lançamento no citosol, Lm associa-se com a maquinaria de polimerização de actina celular que resulta na bactéria sendo envolvida por actina polimerizada. Para confirmar que o extracelular Lm é derivado de actina-rico citoplasma da célula hospedeira infectada, macrófagos foram também deixou não infectados ou infectados com uma cepa prfA * GFP-expressando e a mídia sobrejacente foi coletada na 1.5, 4 e 6 hpi, manchado com faloidina que vincula a actina polimerizada e analisadas por citometria de fluxo. Mídia sobrepondo macrófagos não infectados e infectados continha luz-dispersão bactéria tamanho partículas(Figura 2), no entanto, a única mídia de macrófagos infectados possuía sinais de GFP-positivo dentro desta retenção de tamanho (Figura 2B; painel esquerdo). Houve um aumento de tempo-dependente no aparecimento de macrófagos de Lm na mídia sobrepondo infectado faloidina-positivo (Figura 2B; bem três painéis). Faloidina positivo expressando GFP Lm também foram detectados em lysates preparados a partir de macrófagos infectados (Figura 2C; painel esquerdo). No entanto, nenhum positivo faloidina Lm foi detectado em lysates preparados a partir de macrófagos infectados com uma cepa mutante do GFP-expressando Lm que faltava o factor de virulência ActA que é necessário para recrutar a maquinaria da polimerização de actina a superfície externa da Lm , seguindo o seu lançamento no citosol (Figura 2C; painel direito). Estes suporte de dados, um cenário que, em uma infecção in vitro, modelo extracelular 'emergente' Lm são derivados do citosol da célula infectada.

Além de Lm-codificação fatores, um número de host de fatores têm sido identificados esse impacto Lm infecção celular (ver discussão). Recentemente, o fator de anfitrião perforina-2 (P2) tem demonstrado ser um componente crítico da célula-nível de defesas contra uma série de patógenos bacterianos. Os macrófagos exsudato peritoneal (PEMs) isolados do selvagem-tipo (P2^{+ +}) e P2^{- / -} ratos inicialmente comparàvel estão infectados por Lm medida pelo ensaio de UFC em 1 hpi(Figura 3). Em P2^{+ +} PEMs, o número de CFUs recuperado no hpi 6 é 10-fold maior em comparação com os níveis recuperados no 1 hpi. Semelhantes aos achados publicados anteriormente, em P2^{- / -} PEMs, o número de CFUs recuperado no hpi 6 é 80-fold maior em comparação com os níveis recuperados no 1 hpi⁴. Reforçada Lm proliferação intracelular em P2^{- / -} PEMs foi acompanhada com maiores níveis de viável Lm detectado na mídia sobrejacente em comparação com os níveis detectados em P2^{+ +} PEMs ( Figura 3B). Estes dados mostram que, em um ensaio in vitro que a aparência do emergente extracelular Lm também pode relatar em fatores do hospedeiro que infecção de impacto.

Análise do fígado e infecção in vivo
Além de ensaios in vitro de infecção acima descritos, a infectividade relativa das estirpes de tipo selvagem, atenuadas e hipervirulento Lm também pode ser avaliada por ensaios in vivo de infecção. Ratos foram por via intravenosa co-infectados com uma mistura igual do selvagem-tipo e estirpes deprfALm Δ e 18 h mais tarde foram sacrificados humanamente, fígados extirpado e única célula preparativos foram feitos. Células hepáticas isoladas foram lysed e o lisado resultante submetida a um ensaio de UFC que podia distinguir entre as estirpes de tipo selvagem e ΔprfALm . Comparado à relação de 1:1 entre estas duas linhagens em inóculo original (a ' entrada'), a relação de /wild type ΔprfAem 18 hpi (a ' saída') foi consideravelmente menos do que a unidade (para 6 ratos gama foi 0.001 a 0.330; dizer 0,100) (Figura 4). Em contraste, os ratos infectados co com uma mistura igual do selvagem-tipo e prfA * Lm cepas os rácios de /wild type prfA *variou entre 2,4 e 10.2 (quer dizer 7.1). Esta experiência mostra que a infectividade relativa destes três estirpes de Lm (tipo selvagem, ΔprfAe prfA *) em um organismo intacto se assemelha ao observado em ensaios in vitro de infecção.

O host também pode ser monitorado para determinar se o nível de variação de infecciosidade do selvagem-tipo, ΔprfAe prfA * estirpes são associados com uma gradação correspondente da resposta imune inata. Anteriormente foi demonstrado que macrófagos residentes (células de Küpffer) e infiltrado inflamatórios monócitos e neutrófilos jogar papéis críticos e inter-relacionados em proteger o fígado durante Lm infecção^{5,6, 7,8}. Células preparadas a partir de não infectados de ratos e camundongos infectados com a cepa de Lm de tipo selvagem de GFP-expressando para 18 h foram coradas com marcadores do tipo específico de célula e analisadas por citometria de fluxo. Em termos de não imune as células do fígado (por exemplo, hepatócitos e células endoteliais), não havia diferenças detectáveis entre ratos infectados e não infectados. Em contraste, houve mudanças notáveis relacionados com infecção no fígado em termos de proporção de células do sistema imunológico que coradas positivamente para o antígeno comum leucocitário CD45 (Figura 5A). Especificamente, os ratos infectados com as estirpes de tipo selvagem e prfA^*Lm tiveram níveis significativamente mais elevados de CD45⁺ células no fígado comparado com ratos não infectados, Considerando que os níveis de CD45⁺ células do fígado em camundongos infectados com a tensão deprfALm Δ atenuado não eram notavelmente diferentes do que os níveis observados em ratos não infectados. Para caracterizar ainda mais as duas populações de células imunes residentes e infiltrante, CD45⁺ células podem ser promovidas subtyped. Como observado por outros⁹, uma mudança notável com infecção é o quase total desaparecimento das células de Küpffer residente (CD11b^meados F4/80⁺no fígado) e o concomitante aparecimento de uma população distinta de CD11b^Oi células que representam infiltração de neutrófilos (Figura 5B; painel médio inferior). Também aparecem no fígado em 18 hpi, são CD11b^meados F4/80^– células aparecem que, uma vez que são também Ly6C^Oi, representam infiltrado inflamatórios monócitos (Figura 5B; painéis inferiores direito e médios). Em camundongos infectados estas células este último são as células única em que foi detectado sinal GFP apreciável após 18 hs da infecção (Figura 5-C). Este último achado é semelhante à que recentemente relatado por Jones e D'Orazio, que mostrou que nos ratos, Lm principalmente está associado a Ly6C^Oi monócitos que se infiltrar no intestino após a infecção de origem alimentar¹⁰. O perfil de CD45^Oi células hepáticas de ratos infectados com a cepa deprfA Lm Δ se assemelham dos ratos não infectados enquanto camundongos infectados com a hiper- LmprfA * virulenta modestamente tinham melhorado os níveis de infiltração de neutrófilos e monócitos inflamatórios em comparação com camundongos infectados com a cepa de Lm tipo selvagem (dados não mostrados).

Figura 1 : Infecção de macrófagos cultivados por Listeria monocytogenes (Lm). A linha de celular de macrófagos de rato 264.7 crus infectados in vitro com qualquer selvagem-tipo Lm (wt; círculos preenchidos), atenuado Lm (ΔprfA; círculos abertos) ou hipervirulento (prfA *; abrir praças) cepas Lm (veja texto para detalhes). (A) em 1,5, 3 e 6 horas pós infecção (hpi), macrófagos foram lysed e o conteúdo celular foram analisado pelo teste de unidade (CFU) formadoras. (B) macrófagos infectados brevemente foram tratados com o antibiótico gentamicina para eliminar não-internalizada Lm e no hpi 6 a sobreposição de mídia foi recolhida e analisada por ensaio de UFC. Linha pontilhada representa o limite de detecção do ensaio. Cada ponto de dados representa uma bem independente/infecção e valores de P foram determinados pelo teste t de Student. Mostrados são os resultados de uma única experiência representativa cantou três vezes com resultados semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Actina-limite Lm analisados por citometria de fluxo. A linha de celular de macrófagos de rato 264.7 crus também foram deixados não infectados ou infectados in vitro com GFP-expressando Lm. A mídia sobrejacente foi removida, centrifugado, e o material coletado manchada de ligação de actina faloidina. O material manchado foi analisado por citometria de fluxo e mostrado é as parcelas de espalhamento de luz (A) indicando o canal usado para os níveis de GFP e faloidina-associada de extracelular (ou seja, meios de comunicação-derivado) Lm mostrado em (B). (B) a área indicada representa o GFP/actina duplo positivo Lm e sua abundância em percentagem do totais eventos dentro dos portões de espalhamento de luz. (C) os macrófagos de rato foram infectados com GFP-expressando Lm ou uma estirpe de GFP-expressando Lm falta o gene que codifica a ActA (ΔactA) recruta da maquinaria de polimerização de actina da célula hospedeira para a Superfície de pilha de LM . Em 6 hpi, células infectadas foram lysed e o conteúdo celular lançado, incluindo o intracelular Lm, foram manchado por actina e analisado por citometria de fluxo. Mostrados são os resultados de uma única experiência representativa cantou três vezes com resultados semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Infecção do selvagem-tipo e macrófagos de nocaute perforina-2 por Lm. Macrófagos peritoneais isolaram de qualquer um tipo selvagem (P2^{+ +}; cheio de círculos) ou nocaute (P2^{- / -}; círculos pontilhados) foram infectados in vitro com Lm. (A) em 1 e 6 hpi, macrófagos foram lysed e o conteúdo celular analisado pelo ensaio de UFC. (B) macrófagos peritoneais infectados brevemente foram tratados com o antibiótico gentamicina e no hpi 2,5 e 6 a sobreposição de mídia foi recolhida e analisada por ensaio de UFC. Cada ponto de dados representa uma bem independente/infecção e valores de P foram determinados pelo teste t de Student. Mostrados são os resultados de uma única experiência representativa cantou três vezes com resultados semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Lm infecção do mouse. Grupos de 6 ratos estavam contaminados com uma mistura igual de ambos o selvagem-tipo Lm (wt) e atenuado cepas de Lm (ΔprfA) ou uma mistura igual do selvagem-tipo Lm e hipervirulento (prfA *) cepas. Em 18 hpi ratos a Lm fardo no fígado foi determinado pelo ensaio de UFC. Nesta experiência a estirpe de Lm do selvagem-tipo possui um gene de resistência a antibióticos que lhe permite ser distinguida as cepas mutantes de Lm sensíveis ao antibiótico. Homogenates fígados foram banhados em ambos contendo antibiótico e mídia sem antibióticos e o rácio de mutantes e selvagem-tipo Lm foram plotados. A linha pontilhada representa a proporção de mutante/selvagem-tipo da dose infectante. Os níveis absolutos do selvagem-tipo Lm nas duas coortes de ratos foram CFU/10⁶ fígado células 12 e 15, respectivamente. Mostrados são os resultados de uma única experiência representativa executados duas vezes com resultados semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Resposta imunológica à infecção de Lm no fígado do rato. Os ratos foram que ou não infectados ou sistemicamente infectadas com 2 x 10⁵ CFU de GFP-expressando Lm cepas para preparações de célula única 18 h. de fígados foram analisadas por citometria de fluxo para a expressão de marcadores específicos imunitário e mieloide. (A), a percentagem de células coloração positiva para o marcador de superfície de célula imune-específicas CD45⁺ por 10⁶ isolado total ao fígado células mostradas para não infectados de ratos e camundongos infectados com o selvagem-tipo (wt Lm), atenuado (ΔprfA), ou hipervirulento (prfA *) Lm cepas. É a média de três ratos por grupo e valores de P foram determinados pelo teste t de Student. (B) mostrado nos painéis da esquerda são o perfil de coloração do fígado CD45 de coloração as células de um rato não infectado individual (topo) e um individual wt Lm- infectado (inferior); os painéis de média é mostrado os níveis de expressão de marcadores específicos mieloide CD11b e F4/80, da CD45⁺ células; e os painéis de certo será mostrado os níveis de expressão de Ly6C das células gated indicados. No painel da extrema-direito é mostrada uma sobreposição da Ly6C⁺ células dos ratos infectados e não infectados, incluindo o percentual e intensidades de fluorescência média (IFM) do CD11b^{+ –} de F4/80 células positivas para o portão de Ly6C indicado. É mostrado um rato representativo de 3 ratos por grupo. (C) Ly6C⁺ células derivadas de fígados de ratos infectados e não infectados (descrito (B); painéis de médios e à direito) foram analisados para expressão de GFP por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Devido a seu programa de infecção celular rápida e processive, Lm é um patógeno ideal para sondar celulares atividades que impactam a infecção. Foram identificada uma série de fatores do hospedeiro que positivamente ou negativamente afetar Lm infecção celular^11,12,13,14. Dois desses hospedam fatores caracteriza-se em nosso laboratório, perforina-2 e o inibidor de Heme regulada (P2 e Oi), regulam características distintas do processo de infecção de Lm . Como mostrado na Figura 3, P2 células deficientes são altamente suscetíveis a Lm e esta maior susceptibilidade é também verdadeira dos camundongos nocaute P2⁴. Detalhados estudos comparativos de macrófagos expressando-P2 e P2-deficiente mostraram que as células este último formaram altamente acidificado Lm-contendo phagosomes, o que resultou em reforçada a expressão de genes de virulência. A hipótese de que a expressão do gene de virulência diferencial contribui para a suscetibilidade reforçada de macrófagos P2-deficiente foi apoiada pela conclusão de que o hipervirulento prfA * Coe, que, como mencionado anteriormente, manifesta a sua virulência genes constitutivamente elevado, infectado P2-expressando e macrófagos P2-deficientes igualmente bem⁴. Assim, a disponibilidade de uma hiper- Lm virulenta tornou possível testar a hipótese de que o fator de anfitrião P2 regula negativamente implantação de factor de virulência de patógenos. Para Oi, nos mostrou que este fator de anfitrião regula o tráfico intracelular de Lm , tal que seu surgimento da célula infectada é restrito; Esta atividade celular é provável que as bases para a suscetibilidade reforçada de ratos-deficientes para Lm infecção^15,16.

Em estudos que documentado celulares atividades ocorrendo em poucos minutos de infecção, é crucial que antes de sua incubação co, que tanto as bactérias e as células hospedeiras não são excessivamente expostas a temperaturas flutuantes ou outros ambiental condições que podem ativar respostas de estresse que se sobrepõem (e confundir) atividades induzida por infecção. Para os estudos descritos acima, isso inclui tais pontos aparentemente simples como minimizar o tempo de manipulação de Lm apenas antes de iniciar a infecção. Por exemplo, se uma cultura bacteriana é removida de uma incubadora de 37 ° C a agitação e permitida sentar-se no topo de uma bancada, mudanças na disponibilidade de ambos, temperatura e oxigênio (entre outras coisas) ativará as adaptações que podem afetar a fase inicial de subsequente interação com a célula hospedeira. Da mesma forma, células hospedeiras também são sensíveis à temperatura e mídia turnos que podem afetar a respostas de infecção inicial. Embora na prática é completamente impossível eliminar todas as flutuações de bacteriano e célula hospedeira cultivo condições, reduzindo-lhes tanto quanto possível e que estabelece um plano operacional padrão, variação entre experimentos será minimizada.

Uma variável adicional, que em nossa opinião, a importância de que também é subestimada, é que o uso de antibióticos em modelos de infecção de cultura de células. Gentamicina é muitas vezes o antibiótico de escolha porque é relativamente impermeável à membrana plasmática eucariótica. Na literatura mais antiga e atual, ele geralmente é usado a 50 µ g/mL para matar extracelular (ou seja, não-internalizada) bactérias. Recentemente foi diretamente demonstrado que, quando presente em 25 µ g/mL, há suficiente difusão de gentamicina através da membrana eucariótica matar intracelular Lm¹⁷. Em nossa experiência, este nível de gentamicina mata Lm imediatamente em cima do contato, Considerando que os níveis muito mais baixo, em matar gama 2 e 5 µ g/mL > 99.9% Lm em menos de 5 min⁴. Aleandro e colegas mostraram que as concentrações de gentamicina amplamente utilizado de 25-50 µ g/mL também são suficientes para matar intracelular Yersinia pestis¹⁸. Curiosamente, este grupo também mostrou diferenças consideráveis entre célula tipos em termos de permeabilização de gentamicina, destacando que as condições ideais devem ser determinados para cada par de células do patógeno-hospedeiro.