सेलुलर और जैविक स्तर के मेजबान प्रतिक्रियाओं के लिए जांच करने के लिए एक जीवाणु रोगज़नक़ का उपयोग करना
Summary
हम दोनों विट्रो में और vivo संक्रमण assays कि मेजबान के गतिविधियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एंकोडिंग कारकों का वर्णन ।
Abstract
वहां रणनीतियों की एक किस्म है बैक्टीरियल रोगजनकों जीवित रहने के लिए और एक बार यूकार्योटिक कोशिका के अंदर पैदा करना रोजगार । तथाकथित ‘ साइटोसोलिक ‘ रोगजनकों (लिस्टिरिया मोनोसाइटोजीन, शिगेला फ्लेक्नेरी, बुर्खोल्डेरिया स्यूमोऐल्ली, फ्रांसेला तुलारेन्सिस, और रिक्केटसिया एसपीपी.) द्वारा संक्रमित कोशिका साइटोसोल तक पहुँच प्राप्त करना प्राथमिक धानी झिल्ली को शारीरिक और एंजाइमिक रूप से नीचा करना. cytosol में एक बार, इन रोगज़नक़ों दोनों के रूप में अच्छी तरह के रूप में पर्याप्त यांत्रिक बलों उत्पन्न करने के लिए मेजबान सेल के प्लाज्मा झिल्ली घुसना करने के लिए नई कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए पैदा करते हैं । यहां, हम बताते है कि कैसे एल monocytogenes के सेलुलर संक्रमण चक्र के इस टर्मिनल कदम (एलएम) दोनों कॉलोनी के गठन इकाई assays और प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है और कैसे दोनों रोगज़नक़ और मेजबान एनकोडेड कारकों के उदाहरण दे इस प्रभाव प्रक्रिया. हम यह भी एक करीबी पत्राचार में संवर्धित कोशिकाओं की सुसंस्कृत विट्रो में संक्रमित की गतिशीलता और उन हेपेटिक कोशिकाओं के उन चूहों से व्युत्पंन प्राप्त करने के लिए शो vivo में संक्रमित । ये समारोह आधारित assays अपेक्षाकृत सरल कर रहे है और आसानी से यूकर्योटिक सेल समारोह के नियन्त्रक के लिए खोज आधारित उच्च throughput स्क्रीन के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
Introduction
संक्रमण आधारित प्रायोगिक मॉडल स्वाभाविक रूप से मेजबान और रोगज़नक़, विभिंन रोगज़नक़ संक्रमण रणनीतियों, और रोगज़नक़ के निस्बत की कठिनाई और मेजबान संचालित प्रक्रियाओं की शुरुआत राज्य की स्थिति पर उनकी निर्भरता के कारण चुनौतीपूर्ण है परिणामों के आधार पर । जीवाणु लिस्टिरिया monocytogenes (एल एम) एक आदर्श रोगज़नक़ की वजह से अपनी आनुवंशिक और सूक्ष्मजीवविज्ञानी tractability, अपनी तेजी से और processive सेलुलर संक्रमण रणनीति की मेजबानी की रक्षा प्रतिक्रियाओं जांच बन गया है, और अपेक्षाकृत स्पष्ट इसके सेलुलर-और जैविक स्तर के संक्रमण phenotypes के बीच संबंध । एल एम के सेलुलर संक्रमण चार अलग चरणों के माध्यम से आय1: (i) सेलुलर आक्रमण है कि एल एम के साथ समाप्त एक vacuole के भीतर संलग्न किया जा रहा है; (पप) एल-धानी झिल्ली के विघटन का निर्देश तथा एल एम एल को साइटोसोल में जारी करना; (iii) intracytosolic प्रतिकृति; और (iv) प्लाज्मा झिल्ली के शारीरिक प्रवेश कि या तो सीधे आसन्न कोशिकाओं के संक्रमण में परिणाम (जैसे एक उपकला पत्रक में के रूप में) या, एकांत कोशिकाओं में, एल एम के extracellular वातावरण में जारी. इन चरणों में से प्रत्येक विशिष्ट Lm-इनकोडिंग कारकों द्वारा पदोंनत कर रहे हैं (‘ के रूप में ‘ virulence कारकों को संदर्भित) कि, जब नष्ट कर दिया, दोनों सेलुलर और पशु मॉडल में संक्रमण दोष के कारण. इस सामांय संक्रमण रणनीति स्वतंत्र रूप से तथाकथित ‘ cytosolic रोगजनकों2के एक नंबर से विकसित किया गया है ।
कॉलोनी बनाने वाली इकाई (cfu) assays व्यापक रूप से विट्रो में दोनों का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित कर रहे हैं (यानी, सेलुलर) और साथ ही vivo में (यानी, जैविक) संक्रमण परिणाम. उनके उच्च संवेदनशीलता के अलावा, विशेष रूप से वीवो संक्रमण के लिए, cfu assays रोगज़नक़ आक्रमण और इंट्रासेलुलर अस्तित्व के लिए एक स्पष्ट readout प्रदान/ cfu assays बड़े पैमाने पर दोनों Lm और मेजबान सेल निर्धारकों कि प्रभाव संक्रमण का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन पूर्व अध्ययनों के रूप में जानकारीपूर्ण के रूप में सेलुलर आक्रमण और intracytosolic प्रतिकृति का विश्लेषण किया गया है, cfu assays हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए नहीं है, Lm संक्रमण प्रक्रिया के चौथे चरण को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया: सेलुलर एस्केप. यहां, हम कैसे सेलुलर एस्केप के अपेक्षाकृत सरल साधनों का वर्णन (बाद के रूप में संदर्भित करने के लिए ‘ उद्भव ‘) cfu परख द्वारा निगरानी की जा सकती है (के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रवाह cytometry) और कैसे दोनों रोगज़नक़ के उदाहरण दिखाने के और मेजबान-एनकोडेड कारकों एल एम के इस चरण को विनियमित संक्रमण चक्र । सेलुलर एल एम संक्रमण चक्र के टर्मिनल चरण का विश्लेषण यह संभव अतिरिक्त रोगज़नक़ और मेजबान सेल संक्रमण-विशिष्ट कारकों और गतिविधियों की पहचान करने के लिए कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
अपने तेजी से और processive सेलुलर संक्रमण कार्यक्रम के कारण, एल एम एक आदर्श रोगज़नक़ सेलुलर गतिविधियों है कि प्रभाव संक्रमण की जांच करने के लिए है । मेजबान कारकों की एक संख्या की पहचान की गई है कि या तो सकार…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
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