Med en bakterie patogen att sonden för cellulär och organismnivå-nivå värd Svaren
Summary
Vi beskriver både in vitro- och in vivo infektion analyser som kan användas för att analysera verksamheten i värd-encoding faktorer.
Abstract
Det finns en mängd strategier bakteriella patogener anställa att överleva och föröka sig en gång i eukaryota cellen. De så kallade ‘cytosoliska’ patogenerna (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisoch Rickettsia spp.) få tillgång till den infekterade cellen cytosolen av fysiskt och enzymatiskt förnedrande primära vacuolar membranet. En gång i cytosolen, dessa patogener föröka såväl som generera tillräckliga mekaniska krafter att penetrera plasmamembranet av värdcellen för att infektera nya celler. Här visar vi hur denna terminal steg av cellulära infektion cykeln av L. monocytogenes (Lm) kan kvantifieras genom både kolonibildande enhet analyser och flödescytometri och ge exempel på hur både patogen – och host-kodad faktorer påverkar detta processen. Vi visar också en nära korrespondens av Lm infektion dynamiken i odlade celler infekterade in vitro- och de av nedsatt celler från möss infekterade Invivo. Dessa funktionsbaserade testmetoder är relativt enkel och kan lätt skalas upp för discovery-baserade hög genomströmning skärmar för modulatorer av eukaryota cellens funktion.
Introduction
Infektion-baserade experimentella modeller är till sin natur utmanande på grund av deras beroende av start staten villkoren för värd och patogen, olika patogen infektion strategier och svårigheten att tillskriva patogen – och host-driven processer baserat på resultat. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) har blivit en idealisk patogen sond värd försvar Svaren på grund av dess genetiska och mikrobiologiska tractability, snabb och processive cellulära infektion strategin och den relativt klara förhållandet mellan dess cell – och organismnivå-nivå infektion fenotyper. Cellulära infektionen av Lm fortskrider genom fyra distinkta faser1: (i) cellulär invasion som avslutas med Lm inneslutas inom en vakuol; (ii) Lm-regisserad upplösningen av vakuol membranet och utsättning av Lm i cytosolen; (iii) intracytosolic replikering. och (iv) fysiska genomträngningen av plasmamembranet som resulterar i antingen infektionen av direkt angränsande celler (t.ex. i en epitelial ark) eller i ensliga celler, utsättning av Lm i den extracellulära miljön. Var och en av dessa faser främjas av specifika Lm-kodade faktorer (benämnd ‘virulensfaktorer’) som, när bort, orsaka infektion defekter i både cellulära och djur modeller. Allmän infektion strategin har utvecklats självständigt av ett antal så kallade ‘cytosoliska’ patogener2.
Kolonibildande enhet (CFU) analyser används allmänt att utvärdera både in vitro-(dvs. cellulära) såväl som i vivo (dvs organismnivå) infektion resultat. Förutom deras hög känslighet, särskilt för Invivo infektioner, föreskriva CFU analyser en otvetydig avläsning patogen invasionen och intracellulär överlevnad/spridning. CFU analyser har använts i stor utsträckning att analysera både Lm och mottagande cell bestämningsfaktorer som påverkar infektion. Så informativ som dessa tidigare studier har varit att analysera cellulära invasionen och intracytosolic replikering, CFU analyser har inte, till bäst av vår kunskap, använts för att spåra den fjärde fasen av Lm infektionsprocessen: cellulär fly. Här beskriver vi relativt enkelt hur cellulära utrymningsvägar (hädanefter benämnd ‘uppkomst’) kan övervakas av CFU assay (liksom av flödescytometri) och Visa exempel på hur både patogen – och host-kodad faktorer reglera denna fas av Lm infektion cykel. Analysen av den terminala fasen av cellulära Lm infektion cykeln kan göra det möjligt att identifiera ytterligare patogen och värd cell infektion-specifika faktorer och aktiviteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av dess snabba och processive cellulära infektion program är Lm en idealisk patogen sond cellulära aktiviteter som påverkar infektion. Ett antal värd faktorer har identifierats som antingen positivt eller negativt påverkar Lm cellulära infektion11,12,13,14. Två sådana värd faktorer kännetecknas i vårt laboratorium, Perforin-2 och den reglerade Heme-hämma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
