Summary

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Abstract

Hayatta kalmak için ve bir kez ökaryotik hücre içinde prolifere bakteriyel patojenler istihdam stratejileri çeşitli vardır. Sözde ‘sitozolik’ patojenler (Listeria Monositogenez, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, FRANCISELLA tularensisve Rickettsia’nin spp.) tarafından enfekte hücre sitozol erişim fiziksel ve enzimatik birincil vacuolar membran aşağılayıcı. Bir kez sitozol Bu patojenler hem çoğalırlar yanı sıra yeni hücre bulaştırmak için ana hücresinin plazma zarı nüfuz için yeterli mekanik Kuvvetleri oluşturmak. İşte, L. Monositogenez (Lm) hücresel enfeksiyon döngüsünün terminal bu adımı koloni oluşturan birim testleri ve Akış Sitometresi tarafından sayısal ve nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler etkisi örnekleri bu vermek nasıl göstermektedir işlem. Ayrıca yakın bir ilişkiyi Lm enfeksiyon dinamikler kültürlü hücre tüp bebek bulaşmış ve bu fareler türetilmiş karaciğer hücrelerinin enfekte içinde vivo gösteriyoruz. Bu işlev tabanlı deneyleri oldukça basit ve kolayca keşif dayalı yüksek üretilen iş ekranlar için modülatörler ökaryotik hücre işlevinin için ölçeklendirilebilir.

Introduction

Enfeksiyon tabanlı deneysel modeller bağımlılığını başlangıç durumu koşullar ev sahibi ve patojen, çeşitli patojen bulaşma stratejileri ve patojen ve ana bilgisayar kullanan işlemler atfederek zorluğu nedeniyle doğal olarak zor olan bağlı olarak sonuçlar. Listeria Monositogenez (Lm) bakteri konak savunma yanıt-e doğru onun genetik ve mikrobiyolojik tractability, hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu stratejisini ve nispeten açık nedeniyle soruşturma için ideal bir patojen haline gelmiştir onun cep-organismic düzeyi ve enfeksiyon fenotipleri arasındaki ilişki. Lm hücresel enfeksiyon dört ayrı aşama1ile devam eder: (i) içinde bir çarpıtma; kapalı Lm ile adl hücresel Invasion (II) Lm-yönetmen çarpıtması membran dağılması ve Lm yayın içine sitozol; (III) intracytosolic yineleme; ve her iki bitişik hücreleri (olduğu gibi bir epitel sayfası gibi) enfeksiyon veya soliter hücrelerdeki sonuçları plazma zarı Lm sürümü ekstraselüler ortamın içine (IV) fiziksel nüfuz. Her bu aşamalardan belirli Lmtarafından terfi-kodlanmış faktörler (‘virülans faktörleri’ anılacaktır), silindiğinde, hücresel ve hayvan modellerinde enfeksiyon kusurları neden. Bu genel enfeksiyon strateji sözde ‘sitozolik’ patojenler2bir dizi tarafından bağımsız olarak gelişmiştir.

Koloni oluşturan birim (CFU) deneyleri yaygın olarak tüp bebek her ikisi de değerlendirmek için istihdam (yani, hücresel) olarak içinde vivo de (örneğin, organismic) enfeksiyon sonuçları. Ek olarak içinde vivo enfeksiyonlar, özellikle için onların yüksek hassasiyet patojen işgali ve hücre içi hayatta kalma/yayılması için net bir okuma CFU deneyleri sağlar. CFU deneyleri kapsamlı enfeksiyon etkisi Lm ve konak hücre belirleyicileri analiz etmek için kullanılmaktadır. Bu önceki çalışmalarda hücresel istilası ve intracytosolic çoğaltma çözümlemek için olduğu gibi bilgilendirici, CFU deneyleri bilgimizi, en iyi şekilde Lm enfeksiyon işleminin dördüncü aşamasını izlemek için kullanılmayan,: hücresel kaçış. Burada, biz (bundan böyle ‘olarak ortaya çıkması’ denir) nasıl hücresel kaçmanın bir yolu CFU tahlil (yanı sıra Akış Sitometresi) izlenebilir ve Lm bu aşaması nasıl her iki patojen ve ev sahibi olarak kodlanmış faktörler örnekleri gösteri düzenleyen nispeten basit tarif enfeksiyon döngüsü. Hücresel Lm enfeksiyon döngüsü terminal aşamasının analiz ek patojen ve konak hücre enfeksiyon özgü faktörler ve aktiviteleri tanımlama mümkün yapabilir.

Protocol

Fareler insanca bakım için tüm uygun hükümet kılavuzlarınıza uygun olarak tedavi edildi ve kullanmak, laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık enstitüleri ve bunların kullanımı için tüm bu çalışma Miami Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı tarafından kabul edildi ve kullanım Komitesi (protokol 16-053). 1. enfeksiyon için hücreleri hazırlanması Fare makrofaj gibi hücre kültürünü ham 264.7 DMEM doku kültürü medya % 10 fetal buzağı serum (bundan böyle …

Representative Results

Patojen ve hücresel enfeksiyon etkileyen ev sahibi olarak kodlanmış faktörlerin rolü değerlendirilmesiYukarıda açıklanan enfeksiyon koşulları kullanarak, giriş vahşi tipi Lm yüzde 0.15, kültürlü makrofajlar (şekil 1A) ile ortak kuluçka 1,5 saat sonra kurtarılır. Sonraki 1,5 saat, co kuluçka (3 h sonrası enfeksiyon, HPI) kurtarma uygun Lm 4-fold bir artış oldu ve 3 6 HPI için uyg…

Discussion

Onun hızlı ve ilerleyicidir hücresel enfeksiyonu nedeniyle, Lm enfeksiyon etkisi hücresel aktiviteler soruşturma için ideal bir patojen bir programdır. Ana faktörlerin bir Lm hücresel enfeksiyon11,12,13,14olumlu veya olumsuz yönde etkileyen tespit edilmiştir. İki tür ev sahipliği bizim laboratuvar Perforin-2 ve Heme düzenlenir inhibitörü ile karakterize faktö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACK Lysing Buffer Gibco  A1049201
ArC Amine Reactive Compensation Beads  Life Technologies A10346
BHI (Brain Heart Infusion) broth EMD Milipore 110493
Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Collagenase D Roche 11088858001
DMEM media  Gibco  11965-092
FACS tubes  BD Falcon 352054
FBS – Heat Inactivated  Sigma-Aldrich F4135-500ML
Hanks’ Balanced Salt solution Sigma-Aldrich H6648-6X500ML
LB agar Grow Cells MS MBPE-4040
LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit  Life Technologies L349S9
Rhodamine Phalloidin  Thermo Fischer R415
SP6800 Spectral Analyzer Sony
Syringe 28G 1/2" 1cc BD 329461
TPP Tissue Culture 48 Well Plates  MIDSCI TP92048
TPP Tissue Culture 6 Well Plates  MIDSCI TP92406
UltraComp eBeads eBioscience 01-2222-42
Antigen
CD11b  Biolegend Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11c Biolegend Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45 Biolegend Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80 Biolegend Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead Invitrogen Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100
Ly6C Biolegend Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II Biolegend Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1 Biolegend Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136

References

  1. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
  2. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
  3. Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
  4. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
  5. Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
  6. Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
  7. Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
  8. Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
  9. Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
  10. Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
  11. Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  12. Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
  13. Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
  14. Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
  15. Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
  16. Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
  17. Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
  18. VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).

Play Video

Cite This Article
Gayle, P., Freitag, N. E., Strbo, N., Schesser, K. Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (144), e58775, doi:10.3791/58775 (2019).

View Video