Ved hjælp af en bakteriel patogen til sonden for cellulære og organismens-niveau vært svar
Summary
Vi beskriver både in vitro- og in vivo infektion assays, der kan bruges til at analysere aktiviteterne i host-kodning faktorer.
Abstract
Der er en række forskellige strategier bakterielle patogener ansætte til at overleve og formere sig en gang inde i den eukaryote celle. De såkaldte ‘kemi’ patogener (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensisog Rickettsia spp.) få adgang til den inficerede celle cytosol af fysisk og enzymatisk nedværdigende primære vacuolar membranen. En gang i cytosol, disse patogener såvel formere sig som generere tilstrækkelig mekaniske kræfter at trænge igennem plasma membranen af cellen vært for at inficere nye celler. Her viser vi hvordan denne terminal trin af den cellulære infektion cyklus af L. monocytogenes (Lm) kan kvantificeres ved både kolonidannende enhed assays og flowcytometri og give eksempler på, hvordan både patogen – og host-kodet faktorer indvirkning dette proces. Vi også vise en tæt korrespondance af Lm infektion dynamikken i kulturperler celler inficeret in vitro- og dem af hepatiske celler, der stammer fra mus inficeret in vivo. Disse funktion-baserede assays er relativt simple og let kan skaleres til discovery-baserede høj overførselshastighed skærme for modulatorer af eukaryote cellefunktion.
Introduction
Infektion-baserede eksperimentelle modeller er i sagens natur udfordrende på grund af deres afhængighed af start stat betingelserne for vært og patogen, de forskellige patogen infektion strategier og vanskeligheden ved at tillægge patogen og værtsinitierede processer baseret på resultater. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) er blevet en ideel patogen at sonde vært forsvar svar på grund af dens genetiske og mikrobiologiske sporbarhed, sin hurtige og processive cellulær infektion strategi og den relativt klart forholdet mellem dens cellulær – og organismens-niveau infektion fænotyper. Den cellulære infektion af Lm gennemløber fire særskilte faser1: (i) cellulære invasion, der afslutter hos Lm er indkapslet i en vacuole; (ii) Lm-instrueret opløsning af vacuole membran og frigivelse af Lm i cytosol; (iii) intracytosolic replikering; og (iv) fysiske penetration af plasma membran, som resulterer i enten infektionen direkte tilstødende celler (f.eks. i en epitelial ark) eller ensomme celler, frigivelse af Lm i det ekstracellulære miljø. Hver af disse faser er fremmet af specifikke Lm-kodet faktorer (benævnt “virulens faktorer”), når slettet, forårsage infektion defekter i cellulær og animalske modeller. Denne generelle infektion strategi har været selvstændigt udviklet sig af en række af de såkaldte ‘kemi’ patogener2.
Kolonidannende enhed (CFU) assays er bredt ansat til at evaluere både in vitro (dvs., cellulære) samt in vivo (dvs. organismens) infektion resultater. Ud over deres høj følsomhed, især for in vivo infektioner, give CFU assays en utvetydig udlæsning for patogenet invasion og intracellulære overlevelse/spredning. CFU assays har været flittigt brugt til at analysere både Lm og vært celle determinanter, der påvirker infektion. Så informativ som disse forudgående undersøgelser har været at analysere cellulære invasion og intracytosolic replikering, CFU assays har ikke, at bedst af vores viden, blevet brugt til at spore den fjerde fase af Lm infektion proces: cellulære undslippe. Her beskriver vi relativt simpel, hvordan cellulære udgangsveje (i det følgende benævnt ‘opståen’) kan overvåges ved CFU assay (samt ved flowcytometri) og Vis eksempler på hvordan både patogen – og host-kodet faktorer regulere denne fase af Lm infektion cyklus. Analyse af den terminale fase af cellulære Lm infektion cyklus kan gøre det muligt at identificere yderligere patogen og vært celle infektion-specifikke faktorer og aktiviteter.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af sin hurtige og processive cellulær infektion program er Lm en ideel patogen at sonde cellulære aktiviteter, der påvirker infektion. En række vært faktorer er blevet identificeret, enten positivt eller negativt påvirker Lm cellulære infektion11,12,13,14. To sådanne vært faktorer karakteriseret i vores laboratorium, Perforin-2 og hæm reguleret Inhibitor (P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
