Bruke en bakteriell patogen Probe for mobilnettet og Organismic-nivå vert svar

Infeksjon-baserte eksperimentelle modeller er iboende utfordrende på grunn av sin avhengighet av Start staten betingelsene for verten og patogen, ulike patogen infeksjon strategier og vanskelighetene med å tildele patogen - og vert-drevet prosesser basert på resultater. Bakterien Listeria monocytogenes (Lm) har blitt en ideell patogen å undersøke vert forsvar svar på grunn av sin genetiske og mikrobiologiske tractability sin raske og processive mobilnettet infeksjon strategi og den relativt klart forholdet mellom sin mobil - og organismic-nivå infeksjon fenotyper. Mobilnettet infeksjon av Lm går gjennom fire distinkte faser¹: (i) mobilnettet invasjonen som konkluderer med Lm blir satt i en vacuole; (ii) Lm-oppløsningen av vacuole membranen og utgivelsen av Lm til stoffer; (iii) intracytosolic replikering; og (iv) fysiske penetrasjon av plasma membranen som resulterer i en infeksjon av direkte tilstøtende celler (for eksempel i en epithelial ark) eller i ensom celler, utgivelsen av Lm til ekstracellulære miljøet. Hver av disse fasene er markedsført av bestemte Lm-kodet faktorer (referert til som "virulens faktorer") som, når slettet, forårsake infeksjon defekter i både mobilnettet og dyr modeller. Denne generelle infeksjon strategien er uavhengig utviklet seg av en rekke den såkalte 'cytosolic' patogener².

Colony-forming unit (CFU) analyser er viden ansatt å vurdere både i vitro (dvs. mobilnettet) så vel som i vivo (dvs. organismic) infeksjon resultater. I tillegg til deres høy følsomhet, spesielt for i vivo infeksjoner, gir CFU analyser en entydig avlesning patogen invasjon og intracellulær overlevelse/spredning. CFU analyser har vært mye brukt til å analysere både Lm og verten celle faktorer som påvirker infeksjon. Så informativ som disse tidligere studier har vært å analysere mobilnettet invasjon og intracytosolic replikering, CFU analyser ikke, til best av vår kunnskap, er brukt til å spore den fjerde fasen av Lm infeksjon: cellular flukt. Her beskriver vi relativt enkel hvordan mobil fluktmuligheter (heretter kalt "fremveksten") kan overvåkes CFU analysen (og flowcytometri) og viser eksempler på hvordan både patogen - og vert-kodet faktorer regulere denne fasen av Lm infeksjon syklus. Analyse av terminalen fasen av mobilnettet Lm infeksjon syklusen kan gjøre det mulig å identifisere flere patogen og verten celle infeksjon-spesifikke faktorer og aktiviteter.

Mus ble behandlet humant alle rette offentlige retningslinjer for behandling og bruk av forsøksdyr for av National Institutes of Health og deres bruk ble godkjent for hele denne studien av University of Miami institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (protocol 16-053).

1. klargjør celler for infeksjon

1. Overføre musen macrophage som cellen linje rå 264.7 i DMEM vev kultur medier med 10% fosterets kalv serum (heretter referert til som DMEM/FCS) bruker en 125 mL kolbe og en vev kultur inkubator opprettholdt på 37 °C/5% CO₂.
2. Dagen før infeksjon, bruk cellen skraper å fjerne celler fra ekspansjon kolbe og samle i et 15 mL skrukork konisk rør. Sentrifuge celler 800 x g i 10 min, Dekanter nedbryting og suspendere celle pellet i 1 mL av DMEM/FCS (uten antibiotika) og bestemme titer bruker en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
3. Justere titer til 2 x 10⁶ celler/mL og legge 0.10 mL (2 x 10⁵ celler) til brønner for en 48-og vev kultur parabol. Kontroller at celle suspensjon dekker hele overflaten av brønnen.
   1. Plate cellene i flere brønner for en senere kilde betinget medier. Også plassere 0.10 mL DMEM/FCS i tre flere brønner som en "ingen cellekontroll".
4. Ruge over natten i en vev kultur inkubator på 37 °C/5% CO₂. Neste dag, ikke Fjern fra inkubator til bakterien inoculum er forberedt og klar til bruk.

2. forberedelser Listeria monocytogenes (Lm) for infeksjon

1. Vaksinere 2 mL hjernen-hjertet infusjon (BHI) med en enkelt koloni fra en fersk-stripete agar plate (< 2 dager) av Lm og ruge over natten på 37 ° C med skjelvende på 130 rotasjoner/min.
2. Neste dag, Legg 0.10 mL av natten kultur til 2 mL pre varmet BHI og fortsette rugende på 37 ° C med skjelvende til optisk densitet (OD₆₀₀) er mellom 0,4 og 0,6.
3. Bestemme omtrentlig bakteriell titer bruker en empirisk-avledet konverteringsformelen. I vår lab, en eksponentielt voksende Lm kultur i BHI er ca 1,3 x 10⁹ kolonien danner enheter (CFU) /OD₆₀₀. Minimere tiden bakteriekulturer er utsatt til romtemperatur.
4. Like før infeksjon justere titer 5 x 10⁷ CFU/mL bruker forvarmes DMEM/FCS som fortynner.

3. infeksjon

1. Arbeider raskt og presist, legge til 20 µL (1 x 10⁶ CFU; mangfold av infeksjon, MOI = 5) av nylagde Lm inoculum (trinn 2.4 ovenfor) brønner med litt vippe rett og nøye å plassere Pipetter i overliggende media;
   Merk: unngå å berøre veggene i brønnen med Pipetter spissen.
2. Forsiktig Pipetter innholdet i hver brønn å sikre komplett blanding; ikke rist eller betydelig vippe platen som dette vil spre Lm over veggene av brønnen. Returner celle kultur parabol til 37 °C/5% CO₂ inkubator.
3. Forberede en 10 µg/mL gentamicin løsning bruker betinget medier fra infisert brønner som fortynner.
4. 30 minutter post infeksjon (mpi), nøye legge 30 µL av gentamicin løsning (siste konsentrasjon 2.5 µg/mL) og forsiktig Pipetter innholdet samt før og returnerer celle kultur parabol til 37 °C/5% CO₂ inkubator.
5. På 60 mpi, høste riktig brønner for CFU analysen (60 mpi tidspunkt) eller FCM analyse (som beskrevet nedenfor i avsnitt 4 og 5, henholdsvis).
6. Gjenværende brønner, til forskjellige tider etter høste enten celler som før eller, for Lm fremveksten analysen, helt Fjern medier fra brønnene og erstatte med 150 µL gentamicin-fri betinget medier.

4. prøvetaking behandling og analyse av intracellulær og Emergent Lm av CFU analysen

1. Å høste, lett vippe rett og forsiktig fjerne hele media fra brønnen. Legge til 0.50 mL destillert sterilt vann (dsH₂O) i brønnen. Etter 30 s, overføre det resulterende vannet lysate (10⁰) til en 1,5 mL microcentrifuge rør og vortex kraftig for 10 s.
2. Forbered 10^-1 og 10^-2 fortynninger av enten 4,5 µL eller 50 µL av vannet lysate til 450 µL av dsH₂O og kort vortex å sikre grundig blande.
3. Spre 50 µL av 10⁰, 10^-1 og/eller 10^-2 prøver på lysogeny kjøttkraft (LB) agar plater.
4. Analysen til emergent Lm (trinn 3.6 ovenfor), fjerne 10 µL av overliggende media og dele det i to 5 µL dele: en aliquot legge 5 µL DMEM/FCS og den andre aliquot legge til 5 µL av DMEM/FCS som inneholder 5 µg/mL gentamicin. Sistnevnte kontrollen skiller mellom ekstracellulære Lm (gentamicin følsom) og intracellulær Lm (gentamicin motstandsdyktig) i den påfølgende CFU analysen.
5. Etter 5 min ved romtemperatur, legge til 90 µL av dsH₂O, vortex kraftig for 10 s spredt 50 µL på LB agar plater.
6. Nummerere Lm kolonier på LB agar plater etter 2 dager med inkubering på 37 ° C.

5. prøvetaking behandling og analyse av intracellulær og Emergent Lm av flowcytometri (FCM)

1. Forberede rå 264.7 celler som beskrevet i trinn 1.1-4. Justere celler til 1 x 10⁶ celler/mL og legge til 1 mL (1 x 10⁶ celler) brønner i en 6-og vev kultur parabol.
2. Forberede bakterien inoculum som beskrevet i trinn 2.1-2.3 og infisere celler med volumet av inoculum tilsvarer en MOI 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. På 1,5 timer innlegget infeksjon (hpi), samle medier fra første sett brønner og plasser i en 1,5 mL microcentrifuge rør med 500 µL av 4% paraformaldehyde (PFA) og sted på is til alle brønnene er behandlet.
4. For å samle intracellulær Lm, Legg 1 mL av dsH₂O brønnen og etter 60 s, overføre resulterende vannet lysate til en 1,5 mL microcentrifuge rør med 500 µL på 4% PFA. Vortex kraftig for 10 s og plass på is til alle brønnene er behandlet. (Prøve behandling er beskrevet i trinn 5,8 nedenfor.)
5. Gjenværende brønner, fjerne media og erstatte med 1 mL av DMEM/FCS med 5 µg/mL gentamicin å drepe ekstracellulære Lm og umiddelbart returnere celler til inkubator.
6. Etter 30 min (2 hpi) fjerne media og erstatte med DMEM/FCS uten gentamicin.
7. Etter 2 og 4 h (4 og 6 hpi) ta andre og tredje gang poeng ved å samle medier og lysates som trinn 5.3 og 5.4.
8. Sentrifuge rør på 10.000 x g for 7 min. Fjern nedbryting uten forstyrrende pellets.
9. Suspendere hver pellet i flekker cocktail av 50 µL på 4% PFA og 15 µL av phalloidin. Inkuber rør i mørket ved 4 ° C i 20 min.
10. Etter inkubasjon legge 1 mL av FACS buffer til hver rør og pipette opp og ned for å blande.
11. Spinne rør på 10.000 x g for 7 min. Fjern nedbryting uten forstyrrende pellets.
12. Avbryte hver pellet 400 µL FACS bufferen for umiddelbar bruk, eller 200 µL FACS bufferen og 200 µL på 4% PFA hvis lagre for senere analyse.
13. Kjøre prøver på en flowcytometri og analysere de innsamlede dataene.

6. prøve behandling og analyse av Lm kolonisering og vert svar i leveren

1. Forberede Lm infeksjon som beskrevet i trinn 2.1-2.3.
2. Beregne den nødvendige mengden av subkultur for ønsket titer 3 x 10⁶ CFU/mL.
3. Like før infeksjon fortynne mengden beregnet bakterier med forvarmes Hanks balansert Salt løsning (HBSS) i et siste volum 1 ml. Dette er den inngående inoculum som injiseres i mus.
4. Bruker en 28 G½ 100U insulinsprøyte, tegne 100 µL (3 x 10⁵ CFU) av input inoculum og Fjern alle synlige luftbobler.
5. Plasser musen (belastning C57BL/6, menn mellom 6 og 12 uker gamle) i den holder tilbakeholdenhet bruke varmt vann (ikke mer enn 45 ° C) for å dilate hale blodåre, og injisere den inn inoculum i venen.
6. Plate 10^-2 og 10^-3 fortynninger av input inoculum på LB agar 10bcm plater og ruge over natten på 37 ° C til å bestemme den faktiske input dosen.
7. På 18 hpi, Human euthanize mus (CO₂ kvelning etterfulgt av cervical forvridning) og bruke sterilt saks kuttet åpne mus peritoneum samle frontpartiet flik av leveren bruke separate par pinsett og saks for utsiden og innsiden av musen. Plass leveren i en 6 cm Petriskål på is.
8. Skjær leveren i små terninger og Legg i et hetteglass med magnetic røre bar. Legg 2 mL 2 mg/mL collagenase D rekonstituert i DMEM uten FCS. Inkuber ampuller på 37 ° C på en magnetisk rørestang i 30−45 min. Når vev er homogenisert, legge 3 mL DMEM/FCS å deaktivere collagenase.
9. Filtrere cellene gjennom en 70 µm celle sil i en konisk tube, legger til mer DMEM/FCS om nødvendig.
10. Sentrifuge cellene på 800 x g pellets ved 4 ° C i 10 min, fjerne nedbryting og avbryte celle pellet 500 µL ACK bufferen til lyse røde blodlegemer.
11. Inkuber celler ved romtemperatur for 5 min ACK buffer. Suspendere celler i 1 mL av DMEM/FCS.
12. Sentrifuge cellene på 800 x g pellets ved 4 ° C i 10 min, fjerne nedbryting og suspendere i 1 mL av DMEM/FCS. Deretter telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
13. Overføre 1 x 10⁶ celler til 1,5 mL microcentrifuge rør og spin til pellets. Deretter avbryte 1 mL av dsH₂O og vortex å lyse cellene. Plate 50 µL på LB plater på ufortynnet og 10^-2 fortynninger og ruge på 37 ° C til å nummerere Lm til CFU analyse.
14. Overføre 1 x 10⁶ celler til FACS rør for hver Vevsprøve ifølge celletall og vaskes med 1 mL av FACS buffer.
15. Sentrifuge cellene på 800 x g pellets ved 4 ° C i 10 min og fjerne nedbryting.
16. Forberede en antistoff cocktail som inneholder antistoffer på rente basert på anbefalte konsentrasjonen for hver antistoff og FACS buffer. Se Tabellen for materiale for anbefalte mengder brukt i analysen.
17. Avbryte pellet 100 µL antistoff cocktail og ruge rør i mørket på 4 ° C i 30 min.
18. Etter inkubasjon legge 2 mL FACS bufferen til hver rør og suspendere celler.
19. Sentrifuge cellene på 800 x g pellets på 4 ° C og forkaste nedbryting. Så avbryte pellet 400 µL FACS bufferen for umiddelbar bruk, eller 200 µL FACS bufferen og 200 µL på 4% PFA hvis lagre for senere.
20. Analysere celler av flowcytometri (se trinn 5.13).

Vurdere rollen patogen og vert-kodet faktorer som påvirker mobilnettet infeksjon
Bruker infeksjon forholdene beskrevet ovenfor, er 0,15% av input vill-type Lm gjenopprettet etter 1,5 t med co inkubering med kulturperler makrofager (figur 1A). I den påfølgende 1,5 t med co inkubering (3t innlegget infeksjon, hpi), var det en 4-fold økning i utvinningen av levedyktig Lm og 3-6 hpi var det en ekstra 7.5-fold økning i utvinningen av levedyktig Lm. Siden de celle-ugjennomtrengelig antibiotika gentamicin legges til co kulturer på 1 hpi å eliminere ekstracellulære Lm, representerer 30-fold økningen i levedyktig Lm nivåer mellom 1,5 og 6 hpi utelukkende intracellulær spredning.

Lm får raskt tilgang til stoffer etter sin internalisering i eukaryote celler (se innledningen). Cytosolic Lm knytter begrepsordbok polymerisasjon maskiner av som betyr det driver selv i stand til å trenge gjennom plasma membranen. I i vitro infeksjon analysen beskrevet ovenfor, hvis gentamicin fjernes fra brønnene på 6 hpi ekstracellulære Lm kan lett oppdages 1t senere (7 hpi) i overliggende media (figur 1B). Ingen CFUs ble gjenopprettet fra kontroll brønner som ikke var frø med makrofager, men som var ellers behandles likt som seeded brønner og dermed viser at utseendet på ekstracellulære Lm var helt avhengig av tilstedeværelsen av makrofager og ikke et resultat av ufullstendig antibiotika drap (vises ikke).

Evnen til Lm å overleve og sprer intracellulært er svært avhengig av en rekke gener som uttrykk er kontrollert av transkripsjon faktoren positiv regulatoriske faktor (PrfA)¹. I utgangspunktet er det en tilsvarende utvinning av vill-type Lm belastning og en Lm mutert stamme slettet denne faktoren (ΔprfA) (figur 1A). Men er det en påfølgende reduksjon i utvinningen av ΔprfA belastningen etter langvarig co inkubasjon slik at utvinning på 6 hpi 3-fold mindre enn utvinning på 1,5 hpi. Relatedly og ventet, ble ΔprfA bakterier ikke funnet i overliggende media på 7 hpi (figur 1B).

Aktiviteten til PrfA reguleres på flere nivåer. Et antall constitutively aktive PrfA varianter, kodet av hyper-virulente prfA * alleler, har vært isolert³. En Lm belastning har en prfA * har en innledende infeksjon profil som sammenlignes isogenic vill-type belastningen på 1,5 og 3 hpi (figur 1A). Men mellom 3 og 6 hpi forskjellig brett-økning av prfA * belastningen betydelig fra av vill-type belastningen. Igjen, relatedly og ventet, fant lett prfA * belastningen i overliggende media på 7 hpi på nivåer som betydelig overskredet som observert i vill-type Lm belastningen (figur 1B).

Utgitt i stoffer knytter Lm mobilnettet begrepsordbok polymerisasjon maskiner som resulterer i bakterien er omsluttet av polymerized utgangen. For å bekrefte at ekstracellulære Lm er avledet fra utgangen-rik stoffer av infiserte vert cellen, var makrofager enten venstre smittet eller infisert med en GFP-uttrykke prfA * belastning og overliggende media var samlet på 1.5, 4 og 6 hpi, farget med phalloidin som binder polymerized utgangen, og analysert av flowcytometri. Media overliggende både infisert og smittet makrofager inneholdt lys-spredning bakterie-størrelse svevestøv (figur 2A), men bare media fra infiserte makrofager hadde GFP-positive signaler i denne størrelsen gating (Figur 2B, venstre panel). Det var en tidsavhengige økning i utseendet på phalloidin-positive Lm i media overliggende infisert makrofager (figur 2B, høyre tre paneler). Phalloidin-positive GFP-uttrykke Lm ble også funnet i lysates forberedt fra infiserte makrofager (figur 2C, venstre panel). Men ble ingen phalloidin-positive Lm oppdaget i lysates forberedt fra makrofager infisert med en GFP-uttrykke Lm mutert stamme som manglet virulens faktoren ActA som kreves for å rekruttere utgangen-polymerisasjon maskiner den ytre overflaten av Lm etter utgivelsen i stoffer (figur 2C, høyre panel). Disse dataene støtte et scenario som i en i vitro infeksjon modell "emergent" ekstracellulære Lm er avledet fra infiserte cellen stoffer.

I tillegg til Lm-koding faktorer, en rekke vert faktorer har blitt identifisert som påvirker Lm mobilnettet infeksjon (se diskusjon). Nylig vert faktoren Perforin-2 (P2) har vist seg å være en kritisk komponent i celle-nivå forsvar mot en rekke bakterielle patogener. Peritoneal sårvæske makrofager (PEMs) isolert fra vill-type (P2^{+/ +}) og P2^{- / -} mus er utgangspunktet sammenlignbare infisert av Lm målt ved CFU analysen på 1 hpi (Figur 3A). I P2^{+/ +} PEMs antall CFUs etter at 6 hpi er 10-fold større forhold til nivåer gjenopprettet på 1 hpi. Ligner på tidligere publiserte resultatene, i P2^{- / -} PEMs antall CFUs etter at 6 hpi er 80-fold større sammenlignet med nivåene funnet på 1 hpi⁴. Forbedret Lm intracellulær spredning i P2^{- / -} PEMs sammen med høyere nivåer av levedyktig Lm oppdaget i overliggende media i forhold til nivåene i P2^{+/ +} PEMs ( Figur 3B). Disse dataene viser at i i vitro analysen at utseendet til emergent ekstracellulære Lm kan også rapportere vert faktorer at virkningen infeksjon.

In vivo infeksjon og analyse av leveren
I tillegg til i vitro infeksjon analyser beskrevet ovenfor, kan den relative infectivity av vill-type dempes og hyper-virulente Lm stammer også vurderes av i vivo infeksjon analyser. Mus var intravenøst co-infisert med en lik blanding av vill-type og ΔprfALm stammer og 18 h senere var humant euthanized, lever forbrukeravgift og enkelt celle forberedelsene ble gjort. Isolert leverceller var lysed, og den resulterende lysates utsatt for en CFU analysen som kunne skille de vill-type og ΔprfALm stammene. Sammenlignet med 1:1 forholdet mellom disse to stammer i den opprinnelige inoculum ("inngang"), ΔprfA/wild type forholdet på 18 hpi ("output") var betydelig mindre enn enhet (6 mus området var 0,001 til 0.330, mener 0.100) (Figur 4). Derimot mus co-infiserte med en lik blanding av vill-type og prfA * Lm stammer prfA */wild type forholdstallene varierte fra 2,4 til 10,2 (mener 7.1). Dette eksperimentet viser at den relative infectivity av disse tre Lm belastninger (wild type ΔprfAog prfA *) i en intakt organisme ligner som observert i i vitro infeksjon analyser.

Verten kan også bli overvåket for å avgjøre om hvilket varierende infectivity av vill-type, ΔprfAog prfA * stammer forbundet med en tilsvarende gradering av medfødte immunforsvaret. Tidligere har det vært vist at bosatt makrofager (Küpffer celler) og infiltrere inflammatorisk monocytter og nøytrofile spille kritisk og beslektede roller i å beskytte leveren under Lm infeksjon^{5,6, 7,8}. Celler infisert mus og mus infisert med GFP-uttrykker vill-type Lm belastningen 18 h var farget med celle type-spesifikk markører og analysert av flowcytometri. I ikke-immune celler i leveren (f.eks hepatocytter og endotelceller) var det ingen synlig forskjeller mellom infisert og smittet mus. Derimot var det bemerkelsesverdige infeksjon-relaterte endringer i leveren i andelen av immunceller positivt farget for leukocytter felles antigen CD45 (figur 5et). Spesielt mus infisert med vill-type og prfA^*Lm stammene hadde betydelig høyere nivåer av CD45⁺ celler i leveren sammenlignet med infisert mus mens nivåene av CD45⁺ leverceller i mus infisert med dempes ΔprfALm belastningen var ikke særlig annerledes enn nivåer i infisert mus. Som ytterligere kjennetegner både fastboende og infiltrere immun celle populasjoner, CD45⁺ celler kan være fremmet subtyped. Som observert av andre⁹, et bemerkelsesverdig skifte med infeksjon er nesten komplett forsvinningen av bosatt Küpffer celler (CD11b^{midten av} F4/80⁺i leveren) og samtidig utseendet på forskjellige innbyggere CD11b^Hei celler som representerer infiltrere nøytrofile (figur 5B; nedre midtre panel). Også vises i leveren på 18 hpi, er CD11b^midt F4/80^- celler vises som, siden de også er Ly6C^Hei, representerer infiltrere inflammatorisk monocytter (figur 5B, nedre midtre og høyre panel). I infiserte mus er disse sistnevnte cellene bare celler der merkbar GFP signal ble oppdaget etter 18 hs infeksjon (figur 5C). Dette siste funnet er lik som nylig rapportert av Jones og D'Orazio som viste at mus, Lm primært er tilknyttet Ly6C^Hei monocytter som infiltrere tarmen etter matbårne infeksjon¹⁰. Profilen til CD45^Hei leverceller mus infisert med Lm ΔprfA belastningen lignet som infisert mus mens mus infisert med hyper-virulente LmprfA * belastningen hadde beskjedent forbedret nivåer av infiltrere nøytrofile og provoserende monocytter sammenlignet med mus infisert med vill-type Lm belastningen (data ikke vist).

Figur 1 : Infeksjon i kulturperler makrofager av Listeria monocytogenes (Lm). Musen macrophage celle linjen RAW 264.7 ble smittet i vitro med enten vill-type Lm (wt, fylte sirkler), dempes Lm (ΔprfA, åpne sirklene) eller hyper-virulente (prfA *, åpne ruter) Lm stammer (se tekst for detaljer). (A) på 1.5, 3 og 6 timer innlegget infeksjon (hpi), makrofager var lysed og mobilnettet innholdet ble analysert av colony-forming unit (CFU) analysen. (B) infisert makrofager ble kort behandlet med antibiotika gentamicin å eliminere ikke-internalisert Lm og på 6 hpi overliggende media ble samlet inn og analyseres av CFU analysen. Prikket linje representerer oppdagelsen grensen til analysen. Hvert datapunkt representerer en uavhengig godt/infeksjon og P-verdier ble fastsatt av Student t-test. Vises utføres resultatene av en enkelt representant eksperimentet tre ganger med lignende resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Utgangen-bundet Lm analysert av flowcytometri. Musen macrophage celle linjen rå 264.7 var enten igjen infisert eller infisert i vitro med GFP-uttrykke Lm. Overliggende media ble fjernet, sentrifugeres, og det innsamlede materialet beiset med utgangen-bindende phalloidin. Farget materialet ble analysert av flowcytometri og vise er lys-spredning tomter (A) den gating brukes for GFP - og phalloidin-assosiert nivåer av ekstracellulære (dvs. media-avledet) Lm vises i (B). (B) det angitte området representerer GFP/begrepsordbok dobbel positiv Lm og sin overflod i prosent av totalt hendelsene i lys-spredning portene. (C) musen makrofager var infisert med GFP-uttrykke Lm eller en GFP-uttrykke Lm belastning mangler genet koding ActA (ΔactA) som rekrutterer utgangen-polymerisasjon maskiner av verten cellen til den Lm celleoverflaten. 6 hpi, infiserte celler var lysed og utgitt mobilnettet innholdet, inkludert intracellulær Lm, var farget for utgangen og analysert av flowcytometri. Vises utføres resultatene av en enkelt representant eksperimentet tre ganger med lignende resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Infeksjon av vill-type og Perforin-2 knockout makrofager av Lm. Peritoneal makrofager isolert fra enten en vill-type (P2^{+/ +}; fylt sirkler) eller knockout (P2^{- /-}, prikket sirkler) var smittet i vitro med Lm. (A) på 1 og 6 hpi, makrofager var lysed og mobilnettet innholdet analyseres av CFU analysen. (B) infisert peritoneal makrofager ble kort behandlet med antibiotika gentamicin og på 2,5 og 6 hpi overliggende media ble samlet inn og analyseres av CFU analysen. Hvert datapunkt representerer en uavhengig godt/infeksjon og P-verdier ble fastsatt av Student t-test. Vises utføres resultatene av en enkelt representant eksperimentet tre ganger med lignende resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Lm infeksjon museklikk. Grupper på 6 mus var infisert med en lik blanding av begge vill-type Lm (wt) og dempes Lm (ΔprfA) stammer eller en lik blanding av vill-type Lm og hyper-virulente (prfA *) stammer. På 18 hpi mus Lm ble byrden i leveren bestemt av CFU analysen. I dette eksperimentet besitter vill-type Lm belastningen en antibiotika-motstand-genet som gjør at den skilles fra antibiotika-sensitive Lm mutant påkjenninger. Lever homogenates var belagt på begge antibiotika inneholder og antibiotika-frie medier og forholdet mellom mutant og vill-type Lm var plottet. Den stiplede linjen representerer mutant/vill-type forholdet mellom infisere dosen. De absolutte nivåene av vill-type Lm i to kohortene mus var 12 og 15 CFU/10⁶ leveren celler, henholdsvis. Vises utføres resultatene av en enkelt representant eksperimentet to ganger med lignende resultater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 : Immunologiske respons på Lm infeksjon i musen leveren. Mus var enten infisert eller systemisk infisert med 2 x 10⁵ CFU av GFP-uttrykke Lm stammer for 18 h. encellede tilberedninger lever ble analysert av flowcytometri for uttrykket av immun - og myelogen-spesifikk markører. (A) prosentandelen av celler flekker positivt for immun-spesifikk celle overflaten markøren CD45⁺ per 10⁶ isolert totale live leverceller vises for infisert mus og mus infisert med enten den vill-typen (wt Lm), dempes (ΔprfA), eller hyper-virulente (prfA *) Lm stammer. Middelverdi tre mus per gruppe og P-verdier ble fastsatt av Student t-test. (B) vises i venstre panelene er flekker profilen til CD45 flekker leveren celler fra en individuell infisert musen (øverst) og en individuell wt Lm- infisert (nederst); middels paneler vises uttrykket nivåene for myelogen-spesifikke CD11b og F4/80 av CD45⁺ celler; og på de høyre panelene vises Ly6C uttrykk nivåer av angitte gated cellene. Det høyre panelet vises en overlapping av Ly6C⁺ celler fra infisert og smittet musene inkludert prosent og gjennomsnittlig fluorescens intensiteter (MFI) av CD11b⁺ F4/80^- celler positiv for angitt Ly6C gate. Vist er en representant mus fra 3 mus per gruppe. (C) Ly6C⁺ celler avledet fra lever infisert og smittet mus (beskrevet (B), midtre og høyre paneler) ble analysert for GFP uttrykket av flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

På grunn av sin raske og processive mobilnettet infeksjon program er Lm en ideell patogen å undersøke mobilnettet aktiviteter som påvirker infeksjon. En rekke vert faktorer har blitt identifisert som enten positivt eller negativt påvirker Lm , mobilnettet infeksjon,^11,,^12,,^13,,¹⁴. To slike vert faktorer preget i vårt laboratorium, Perforin-2 og den Heme regulert Inhibitor (P2 og), regulere distinkte egenskaper av Lm infeksjon. Denne forbedrede mottakelighet også er sant av P2 knockout mus⁴som vist i Figur 3, P2 mangelfull celler er svært utsatt for Lm . Detaljert komparative studier av P2-uttrykke og P2-mangelfull makrofager viste at sistnevnte cellene dannet svært sur Lm-som inneholder phagosomes som resulterte i forbedret virulens genuttrykk. Hypotesen om at differensial virulens genuttrykk bidrar til økt mottakelighet av P2-mangelfull makrofager ble støttet av finne at den hyper-virulente prfA * belastning, som, som nevnt tidligere, uttrykker virulens gener constitutively høy, infisert P2-uttrykke og P2-mangelfull makrofager like godt⁴. Dermed tilgjengeligheten av en hyper-kraftig Lm forstuing gjort det mulig å teste hypotesen at P2 vert faktoren negativt regulerer patogen virulens faktor distribusjon. For Hei, vi viste at denne verten faktoren regulerer intracellulær smugling av Lm slik at dens fremvekst fra infiserte cellen er begrenset; Denne cellulære aktiviteten er sannsynlig baser for forbedret mottakelighet av Hei-mangelfull mus Lm infeksjon^15,16.

I studier som dokumentert mobilnettet aktiviteter innenfor minutter av infeksjon, er det avgjørende at før deres co inkubasjon at både bakterier og verten cellene ikke er overdrevet utsatt for varierende temperatur eller andre miljømessige forhold som kan aktivere stressresponser som ville overlapper (og forvirre) infeksjon-indusert aktiviteter. For studier som beskrevet ovenfor, inkluderer dette slike tilsynelatende enkle punkter som minimere håndtering tid Lm like før starte infeksjon. For eksempel hvis en bakteriell kultur er fjernet fra en risting 37 ° C inkubator og lov til å sitte på en benk toppen, vil endringer i temperatur og oksygen tilgjengelighet (blant annet) aktivere tilpasninger som kan påvirke den første fasen av den påfølgende samspill med verten celle. Tilsvarende er verten cellene også følsom for temperatur og media Skift som kan påvirke innledende infeksjon svar. I praksis er det umulig å helt eliminere alle svingninger i bakteriell og verten celle dyrking forhold, ved å redusere dem så mye som mulig og å etablere en standard operativsystem plan, variasjon mellom eksperimenter minimeres.

En ekstra variabel, som etter vår mening betydning er også underappreciated, er bruken av antibiotika i celle kultur infeksjon modeller. Gentamicin er ofte antibiotika valg fordi det er relativt ugjennomtrengelig til eukaryote plasma membranen. I både eldre og gjeldende litteratur, er det vanligvis brukt på 50 µg/mL for å drepe ekstracellulære (dvs. ikke-internalisert) bakterier. Nylig har det vært direkte vist at når stede på 25 µg/mL, det er tilstrekkelig spredningen av gentamicin over eukaryote membranen å drepe intracellulær Lm¹⁷. I vår erfaring, dette nivået av gentamicin dreper Lm umiddelbart ved kontakt, mens mye lavere nivåer, i 2 til 5 µg/mL utvalg drepe > 99,9% Lm på mindre enn 5 min⁴. Lawrenz og kolleger har vist at de brukte gentamicin konsentrasjonene av 25-50 µg/mL er også tilstrekkelig å drepe intracellulær blodlegemer¹⁸. Interessant, denne gruppen viste også store forskjeller mellom cellen typer i gentamicin permeabilization fremhever de optimale forholdene bør fastsettes for hver patogen-verten celle tilkobling.