プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

感染症に基づく実験的モデル、ホスト、そして病原体、様々 な病原体の感染戦略と病原体がホスト主導するプロセスに結び付ける難易度の開始状態への依存のために本質的に挑戦結果に基づきます。菌リステリア菌(Lm) の遺伝学的および微生物学的少ない、その迅速かつプロセッシブ細胞感染戦略と比較的明確なのためのに対する宿主の防御をプローブする理想的な病原体となっています。その携帯と生体レベルの感染症の表現型間の関係。Lmの細胞感染を通過 4 段階¹: (i) Lm ; 液胞で囲まれた中で結んで細胞浸潤(ii) Lm-液胞膜の溶解と細胞質; にLmの放出を指示(iii) intracytosolic レプリケーションそして (iv) 膜結果直接隣接する細胞 (上皮シートなど) のどちらかの感染または孤独な細胞は細胞外の環境にLmのリリースの物理的な侵入。特定Lmによって促進される、これらの各フェーズ-要因 ('病原因子」と呼ばれる) をエンコードされたが、削除されると、原因の感染欠陥細胞と動物のモデル。この一般的な感染戦略されて独立して進化しているいわゆる '細胞' 病原体²の数によって。

コロニー形成単位 (CFU) 試金は体外の両方を評価するため利用されています (すなわち、細胞) 同様の in vivo (すなわち、,) 感染症の結果。生体内での感染症のために特に感度が高くに加えて CFU の試金は病原体の侵入と細胞の生存/増殖のため明確な読み出しを提供します。CFU アッセイは、感染に影響を与えるLmとホストの両方の細胞の要因を分析するため広く使用されています。これらの先行研究は細胞浸潤と intracytosolic レプリケーションを分析されている有益 CFU の試金、我々 の知識を最大限に使用されていないLm感染プロセスの第 4 段階を追跡する: 細胞エスケープ。ここでは、比較的単純な CFU の試金 (およびフローサイトメトリーによって) (以下、出現') 携帯の脱出の手段を監視ことができ、どのように両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の例を示す規制Lm のこの段階について述べる感染サイクル。携帯電話のLm感染サイクル ターミナル相の解析追加病原体および宿主細胞感染特異的因子と活動を識別することが可能になります。

ケアのため、すべての適切な政府ガイドラインに従ってマウスが人道的扱われ、国立衛生研究所の実験動物の使用とその使用方法は、この全体の研究のためのマイアミ大学の制度上の動物の世話が承認されましたおよび使用委員会 (プロトコル 16 053)。

1. 感染症の細胞を準備

1. DMEM 培養培地 10% 牛胎児血清 (今後 DMEM/FCS と呼ばれる) でマウスのマクロファージ様細胞ライン未加工 264.7 の伝達 125 mL フラスコと 37 °C/5% CO₂で維持培養インキュベーターを使用しています。
2. 感染前に、の日は、拡張フラスコからセルを削除し、15 mL スクリュー キャップの円錐管の収集に細胞スクレーパーを使用します。800 x gで 10 分間で細胞を遠心、上清をデカントし (抗生物質) なし DMEM/FCS の 1 mL の細胞ペレットを中断し、検定または自動化された細胞カウンターを使用して抗体価を決定します。
3. 2 x 10⁶セル/mL に価を調整し、48 ウェル培養皿の井戸に 0.10 mL (2 x 10 の⁵セル) を追加します。細胞懸濁液が井戸の表面全体をカバーすることを確認します。
   1. プレート細胞調節されたメディアの後でソースの追加の井戸。また 'ないセル コントロール' として機能する 3 つの追加井戸に DMEM/FCS の 0.10 mL を配置します。
4. 37 °C/5% CO₂で組織文化のインキュベーターで一晩インキュベートします。菌接種が準備し、使用する準備ができているまで、インキュベーターから次の日には取り外さないでください。

2. 感染症のリステリア菌(Lm) を準備します。

1. たてすじの寒天から単一コロニー脳心臓注入 (BHI) 2 mL を接種する (< 2 日) Lmの 130 回転/分の振動で 37 ° C で一晩インキュベートし、。
2. 次の日、追加 2 mL に一晩文化の 0.10 mL BHI で加温し、光学濃度 (OD₆₀₀) が 0.4 と 0.6 まで揺れで 37 ° C で培養を続けます。
3. 経験的派生変換式を使用しておおよその細菌抗体価を決定します。私たちの研究室で BHI で指数関数的に成長のLm文化は約 1.3 × 10⁹コロニー形成単位 (CFU)/OD₆₀₀。細菌文化は、部屋の温度にさらされている時間の量を最小限に抑えます。
4. 感染の直前に 5 × 10⁷ CFU/mL の希釈剤として予め温めておいた DMEM/FCS を使用して力価を調整します。

3. 感染症

1. 20 μ L を追加作業迅速かつ正確には、(1 x 10⁶ CFU; MOI 感染症の多様性 = 5) 皿の少し傾斜上を覆うメディアのピペット先端部を慎重に配置することによって井戸に出来立てLm接種 (2.4 上記のステップ) の
   注:ピペット先端部の井戸の壁には触れないでください。
2. 優しくをピペットで移しなさいように各ウェルの内容完了混合;振る、これが井戸の壁上のLmを分散大幅プレートを傾斜したりしないでください。細胞培養ディッシュを 37 °C/5% CO₂インキュベーターに戻ります。
3. 感染していない井戸から調節されたメディアを使用して希釈液として 10 μ g/mL ゲンタマイシン溶液を調製します。
4. 30 分で感染症 (mpi) の記事、慎重にゲンタマイシン液 (最終濃度 2.5 μ g/mL) と優しくピペット 30 μ L に 37 °C/5% CO₂インキュベーター戻り細胞培養ディッシュ、前に同様の内容を追加します。
5. 60 mpi で (それぞれ 4、5 のセクションで後述) として CFU の試金 (60 mpi 時点) または FCM 解析のいずれかの適切な井戸を収穫します。
6. 残りの井戸、ゲンタマイシン無料エアコン メディアの 150 μ L で取り外して交換井戸からメディアが完全する前に、または、 Lm出現の試金のための細胞を収穫どちらかその後の様々 な時。

4. サンプリング CFU アッセイによる細胞内と創発のLmの処理と解析

1. 収穫、料理を少し傾けるし、井戸からメディア全体を慎重に取り外します。井戸に 0.50 mL 滅菌蒸留水 (dsH₂O) を追加します。30 後 s、結果水のライセートを転送 (10⁰) 1.5 mL 容マイクロ チューブと精力的に 10 の渦に s。
2. 準備 10^-1および 10^-2希薄か 4.5 μ L または dsH₂O の 450 μ L に溶解水の 50 μ L と簡単に渦徹底的な混合を確実を追加します。
3. 10 の 50 μ L を広めるホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレート 10^-2サンプルや 10^{-1 0}。
4. 創発的Lm (3.6 上記のステップ) の試金し、オーバーレイするメディアの 10 μ L を削除 2 つ 5 μ 因数に分割: 1 つの因数を追加 DMEM/FCS と 2 番目の約数を 5 μ L 5 μ G/ml ゲンタマイシンを含む DMEM/FCS の 5 μ L を追加。後者のコントロールを区別細胞外Lm (機密ゲンタマイシン) と細胞内Lm (ゲンタマイシン耐性) 以降 CFU で試金。
5. 室温で 5 分後に LB 寒天培地プレート上 dsH₂O、10 s は積極的に渦の 90 μ L と拡散 50 μ L を追加します。
6. 次の 2 日の 37 ° c. で孵化 LB 寒天培地プレート上のLmコロニーを列挙します。

5. サンプリング処理とフローサイトメトリー (FCM) による細胞内と創発のLmの解析

1. 1.1 4 の手順で説明するように、未加工 264.7 のセルを準備します。1 x 10⁶セル/mL にセルを調整し、6 ウェル培養皿の井戸に 1 mL (1 x 10 の⁶セル) を追加します。
2. 2.1 2.3 の手順で説明するように菌接種を準備し、50 (5 x 10⁷ CFU) の慣性モーメントに対応する接種量と細胞に感染します。
3. 1.5 時間ポスト感染 (hpi)、井戸の最初のセットからメディアを収集し、すべての井戸が処理されるまで 4% パラホルムアルデヒド (PFA)、氷の上の場所の 500 μ L で 1.5 mL 遠心チューブに配置。
4. 細胞内Lmを収集するために井戸の中に、60 歳以降後に dsH₂O の 1 mL を追加 s、4% の 500 μ L で 1.5 mL 遠心チューブに生じる水ライセートを転送 PFA。10 s およびすべての井戸が処理されるまで氷の上場所は積極的に渦。(サンプル処理は 5.8 以下の手順で説明します)。
5. 残りの井戸のメディアを取り出し、細胞外Lmを殺すために、速やかに細胞をインキュベーターに戻ります 5 μ G/ml ゲンタマイシンと DMEM/FCS の 1 mL に置き換えます。
6. 30 分 (2 hpi) 後にメディアを取り出し、ゲンタマイシンなし DMEM/FCS に置き換えます。
7. 2 と 4 h (4 と 6 の hpi) 後 2 番目と 3 番目 5.3 および 5.4 の手順としてメディアと溶解液を集めることによってポイントを時間します。
8. 不穏なペレットなし 7 分削除清 10,000 x gでチューブを遠心します。
9. 4% の 50 μ L のカクテルを染色でペレットを中断 PFA とファロイジン 15 μ L。4 ° C、20 分で暗闇の中のチューブを孵化させなさい。
10. 孵化後各管し、ミックスを上下にピペット 1 mL の FACS バッファーを追加します。
11. 不穏なペレットなし 7 分削除清 10,000 x gでチューブをスピンします。
12. すぐに使用、FACS バッファーの 400 μ L または FACS バッファーの 200 μ L、200 μ L 4% のペレットを中断 PFA を後で分析を格納する場合。
13. Cytometry 流れのサンプルを実行し、収集されたデータを分析します。

6. サンプリング処理とLm植民地化し、肝臓でのホスト応答の解析

1. 2.1 2.3 の手順で説明するよう、感染症のLmを準備します。
2. 3 × 10⁶ CFU/mL の希望価のサブカルチャーの必要量を計算します。
3. 感染の直前に計算される細菌で予め温めておいたハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 1 mL の最終巻での量を希釈します。これは、マウスに注入される入力の接種です。
4. 28 G½ 100U インスリン注射器を使用して、入力菌の 100 μ L (3 x 10⁵ CFU) を描画し、目に見える空気の泡を削除します。
5. 持株拘束にマウス (緊張 C57BL/6; 6 および 12 週古い間の男性) を配置、尾静脈を拡張する暖かい水 (45 ° C 以上) を使用し、入力の接種を静脈に注入します。
6. プレート 10^-2と LB 寒天の 10bcm に入力の接種の 10^-3希薄と実際の入力の量を決定するための 37 ° C で一晩インキュベートします。
7. 18 hpi の人道的安楽死させるマウス (CO₂窒息頚部転位続いて) と外と内のピンセットとはさみの別のペアを使用して肝臓の前頭葉を収集する滅菌はさみカット オープン マウス腹膜を使用マウス。6 cm シャーレ氷の上に肝臓を配置します。
8. 小さなキューブに肝臓を切り取り、電磁攪拌棒とガラスの瓶に。2 mg/mL コラゲナーゼ FCS なし DMEM で再構成した D の 2 mL を追加します。マグネチックスターラー 30−45 分の 37 ° C でバイアルを孵化させなさい。組織をホモジナイズ DMEM/fcs、コラゲナーゼを不活化する 3 mL を追加します。
9. セルを 70 μ m セル ストレーナーより DMEM/FCS を必要に応じて追加、円錐管にフィルターします。
10. 10 分のための 4 ° C でペレット、上清を除去および赤血球を溶解する ACK バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを中断する 800 x gで細胞を遠心します。
11. セル ACK バッファーで 5 分間室温で孵化させなさい。DMEM/FCS の 1 mL の細胞を中断します。
12. 4 ° c 10 分のペレット、上清を除去および DMEM/FCS の 1 mL に中断する 800 x gで細胞を遠心します。次に、診断または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。
13. 餌のためにスピンして 1.5 mL 遠心チューブに 1 x 10 の⁶セルを転送します。DsH₂O と、細胞を溶解する渦の 1 つの mL で、停止します。原液で LB プレートに 50 μ L および 10^-2希薄をプレートし、CFU 解析のLmを列挙する 37 ° C で孵化させなさい。
14. セルのカウントによると各組織サンプルの FACS チューブに 1 x 10 の⁶セルを転送し、FACS バッファーの 1 つの mL で洗います。
15. 800 × g 10 分のための 4 ° C でペレット、上清を除去し、細胞を遠心します。
16. 各抗体および FACS バッファーの推奨濃度に基づく興味の抗体を含む抗体カクテルを準備します。分析で使用推奨量の材料表を参照してください。
17. 抗体カクテルの 100 μ L でペレットを中断し、30 分のための 4 ° C で暗闇の中のチューブを孵化させなさい。
18. インキュベーション後、各管に 2 mL の FACS バッファーを追加し、細胞を中断します。
19. 4 ° C でペレット、上澄みを廃棄し 800 x gで細胞を遠心します。すぐに使用、FACS バッファーの 400 μ L または FACS バッファーの 200 μ L、200 μ L 4% のペレットを中断 PFA 後保管する場合。
20. フローサイトメトリーによる細胞を分析 (手順 5.13 参照)。

病原体と感染細胞に影響を与えるホスト エンコード要因の役割を評価します。
上記の感染条件を使用して、入力の野生型Lmの 0.15% は 1.5 h 培養マクロファージ (図 1A) と共同の孵化の後回復します。共同インキュベーション (3 h ポスト感染、hpi) の後続の 1.5 h で実行可能なLmの回復で 4 倍の増加があったし、3 6 hpi から実行可能なLmの回復の追加 7.5-fold 増加があった。以来、細胞外Lmをなくす 1 hpi で共培養する細胞不浸透性の抗生物質のゲンタマイシンを追加すると、1.5 〜 6 hpi の間に実行可能なLmレベルで 30 倍の増加は専ら細胞内増殖を表します。

Lmは真核細胞 (概要を参照) 内でその内面に続く細胞質に急速にアクセスします。ゾル性細胞質のLmは、どの手段によってそれは自体は細胞膜を貫通する能力を推進するアクチン重合機械に関連付けます。In vitro 感染アッセイのゲンタマイシン 6 hpi で井戸から削除した場合、上記で説明した、細胞外Lm容易に検出できる 1 h 後 (7 hpi) 覆うメディア (図 1B)。コントロールの井戸にはマクロファージと播種はないをそれ以外の場合それにより細胞外Lmの外観は、マクロファージの存在に完全に依存ことを示すシードの井戸として同じ症例から CFUs も回収されませんでしたと(表示されていません) 不完全な抗生物質殺害の結果ではないです。

Lm存続し、細胞内で増殖するの機能は遺伝子が式のスイートに依存 (PrfA)¹転写因子陽性因子によって制御されます。当初は、野生型LmひずみとLmの変異株 (ΔprfA) この要因の削除を匹敵する回復がある (図 1A)。ただし、6 hpi で回復が 1.5 hpi で回復 3 倍未満になるよう、長期の共同培養後 ΔprfAひずみの回復にその後減少があります。関連して、予想通り、7 hpi (図 1B) を覆うメディアの ΔprfA細菌は検出されなかった。

PrfA の活動は、複数のレベルで規制されています。ハイパー病原性prfA *対立遺伝子、によってエンコードされた恒常活性の PrfA の亜種の数は、分離された³をされています。所持prfA * Lm株は、1.5 〜 3 hpi (図 1A) で同質遺伝子野生型株に匹敵する最初の感染プロファイルを持っています。ただし、3 と 6 の hpi の間prfAの負担の倍は大幅野生型株のそれと異なった。また、関連して、予想通り、 prfAの負担が野生型Lmひずみ (図 1B) の観察を大幅に上回ったレベル 7 hpi で上を覆うメディアの検出されました。

次の細胞質へのリリース、その重合のアクチンに抱かれて菌による細胞のアクチン重合機械にLmを関連付けます。細胞外Lmは感染させた宿主細胞のアクチンの豊富な細胞質に由来することを確認するには、マクロファージが感染していないまたは gfp 発現するprfA *ひずみと感染した左し、上を覆うメディアは 1.5、4、および 6 の hpi で収集されました。重合のアクチンを結合し、フローサイトメトリーで分析したファロイジンで染色。光散乱細菌サイズ粒子状物質 (図 2A) が感染して感染したマクロファージをオーバーレイのメディアに含まれている、ただし、感染させた大食細胞から唯一のメディアはこのサイズのゲート内での GFP 陽性信号を所有していた(図 2B; 左側のパネル)。ファロイジン正Lmオーバーレイのメディアで感染したマクロファージ (図 2B; 右 3 つのパネル) の外観の時間依存の増加があった。ファロイジン正 gfp 発現するLmは、感染させた大食細胞 (図 2C; 左側のパネル) から調製した溶解液でも検出されました。ただし、ファロイジン正Lmは認められなかったアクチン重合機械を募集するために必要な毒性因子 ActA に欠けていた gfp 発現するLmの変異株が感染したマクロファージから調製したライセートLm細胞質 (図 2C; 右側のパネル) にそのリリースを次の外側の表面。これらのデータのサポートは、感染した細胞の細胞質に由来する in vitro 感染で '緊急' 細胞外Lmをモデル化したシナリオ。

Lmに加えて-の要因をエンコード、要因をされているホスト数識別Lm細胞感染に影響を与える (ディスカッションを参照してください)。最近では、宿主因子パーフォリン 2 (P2) は病原性細菌の数に対する細胞レベル防御の重要なコンポーネントであると示されています。腹腔滲出マクロファージ (PEMs) 野生型から分離された (P2^+/+) P2^-/-マウスは、 Lm 1 hpi (図 3A) CFU の試金によって測定されるように感染して最初対等。P2^+/+ Pem CFUs の数 6 hpi で回復 10 倍大きい 1 hpi で回復レベルに比較します。P2の以前に公開された所見のよう^-/-多く CFUs の復旧 6 hpi Pem が 80-fold 大きい 1 hpi⁴で回復のレベルと比較して。強化P2^-/- Pem における細胞内増殖が可能なLm P2の検出レベルと比較して上を覆うメディアの検出のより高いレベルを伴ったLm ^+/+ Pem (図 3B)。これらのデータを示す in vitro における創発的細胞外Lmの外観がその影響感染、宿主因子のも報告すること。

体内の感染症と肝臓の分析
上記で説明した in vitro 感染の試金に加え野生型、弱毒化、およびハイパー劇毒性Lm系統の感染性は相対的なも体内感染の試金によって評価できます。マウス静脈内共同感染野生型の等量混合物と ΔprfALm系統と 18 h 後人道的安楽死させ、肝臓切除、および単一セルの準備が行われました。分離肝細胞を溶解し、結果の lysates を受ける野生型および Δ のprfALm系統を区別できる CFU の試金。菌 (入力) これらの 2 つの系統の 1:1 の比率と比べると、18 hpi (出力) ΔprfA/wild type 比率となりました団結よりもかなり少ない (6 匹のマウスの範囲は 0.001 にウェバー 0.330; 0.100 を意味) (図 4)。対照的に、共同感染マウスと野生型の等量混合物とprfA * Lm系統の 〜 2.4 (平均 7.1) 10.2 prfA */wild type 比。この実験は、in vitro 感染アッセイで観測されたこれら 3 Lmの系統 (野生型、ΔprfA、 prfA *) そのまま生体内の相対的な感染に似ていることを示しています。

ホストは、野生型、ΔprfA prfAの系統の感染性の様々 なレベルの生得の免疫反応の対応するグラデーションに関連付けられているかどうかを監視できます。その住民の大食細胞 (Küpffer 細胞) と浸潤炎症性単球とLm感染^{5,6、肝臓を保護する役割を好中球果たす重要な相互に関連することが示されている以前 7,8}。感染していないマウスと 18 h の gfp 発現する野生型Lm株感染マウスから作製した細胞細胞型-特異的マーカーで染色、フローサイトメトリーで分析しました。肝臓 (肝細胞と血管内皮細胞など) の非免疫細胞、面で検出感染して感染マウスの違いはありませんでした。対照的に、白血球共通抗原 CD45 染色免疫細胞の割合の面で肝臓に注目すべき感染症に関連する変更があった (図 5A)。具体的には、 prfA^*Lmと野生型株感染マウスは CD45 の大幅に高いレベルを持っていた一方、感染していないマウスに比べて肝細胞の⁺ CD45 レベル⁺感染マウスにおける肝細胞弱毒 ΔprfALm株は感染していないマウスで観察されるレベルよりも顕著に異なるでした。さらに両方の居住者および浸潤の免疫細胞群を CD45 を特徴付ける⁺細胞を進めたことができますサブタイプします。⁹他の人が, 感染症の顕著なシフトは (CD11b^半ばF4/80 肝に⁺) 居住者の Küpffer 細胞のほぼ完全な消失と CD11b の明瞭な人口の併用の外観^{こんにちは}好中球の浸潤を表す細胞 (図 5B; 下中央のパネル)。18 hpi で肝臓にも登場、CD11b^半ばF4/80^-セル表示を表す、以来、彼らはまた、Ly6C^こんにちは、(図 5B; 下真ん中と右のパネル) 炎症性単球浸潤であります。感染マウスにおけるこれらの後者のセル、次の感染症 (図 5C) の 18 hs かなり GFP シグナルが検出されただけのセルです。このことは、ジョーンズとマウスでLm主に関連付けられている Ly6C^{こんにちは}球次の食品媒介感染症¹⁰腸に侵入をした d ' オラツィオによって最近報告されているに似ています。超強毒のLmprfA *株感染マウスいた控えめのレベルを強化に対して感染マウスの肝 CD45^{こんにちは}細胞のLm ΔprfA株感染マウスのプロファイルに似ています。好中球と野生型Lmひずみ (データは示されていない) 感染マウスと比較して炎症性単球浸潤。

図 1: 感染リステリア菌(Lm) によって培養マクロファージ。マウスのマクロファージ細胞株未加工 264.7 は、いずれかの野生型と体外感染したLm (wt; 塗りつぶされた円)、弱毒Lm (ΔprfA; 白抜きの円)、またはハイパー病原性 (prfA *; オープン正方形) Lm系統(詳細は本文を参照してください)。(A) で 1.5、3、および 6 時間ポスト感染 (hpi)、大食細胞を溶解し、コロニー形成単位 (CFU) アッセイによる細胞の内容を行った。(B) 感染したマクロファージは非内面Lmを除去するために抗生物質のゲンタマイシンと簡潔に扱われたと 6 hpi でオーバーレイするメディアを集めた後、CFU アッセイによる解析。点線は、アッセイの検出限界を表します。各データ ポイントは独立した井戸/感染症を表し、スチューデントの t 検定による P 値を求めた。示すように単一の代表的な実験の結果を行った 3 回と同様の結果でこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: アクチン バインドLmフローサイトメトリーします。未加工 264.7 の残っていたかマウスのマクロファージ細胞株感染または gfp 発現するLmの in vitro 感染します。覆っているメディアが削除された、遠心分離、および収集資料はアクチン結合ファロイジンで染色します。ステンド グラスの素材はフローサイトメトリーによる解析し、光散乱プロット (A) は細胞外の GFP と最も関連するレベルで使用するゲートを示す表示 (すなわち、メディア派生) Lm (B) に示すように。(B) 指定されたエリアは、GFP/アクチン二重肯定的なLmと光散乱ゲート内にあるイベントの総数の割合としての豊かさを表します。(C)マウスのマクロファージの gfp 発現するLmまたは募集する宿主細胞のアクチン重合機械 ActA (ΔactA) の遺伝子に欠けている gfp 発現するLmひずみのいずれかに感染していた、Lm細胞の表面。6 hpi に感染した細胞を溶解し、細胞内のLmを含むリリースの細胞内容がアクチン染色、フローサイトメトリーで分析しました。示すように単一の代表的な実験の結果を行った 3 回と同様の結果でこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 野生型およびLmでパーフォリン 2ノックアウト マクロファージへの感染します。野生型のいずれかから分離した腹腔内マクロファージ (P2^+/+; 円をいっぱい) またはノックアウト (P2^-/-; 点線の円) は、 Lmの in vitro 感染していた。(A) で 1 と 6 の hpi、大食細胞を溶解し、CFU アッセイによって細胞の内容を分析しました。(B) 感染したマクロファージは抗生物質のゲンタマイシンと簡潔に扱われたと 2.5 と 6 hpi でオーバーレイするメディアを集めた後、CFU アッセイによる解析。各データ ポイントは独立した井戸/感染症を表し、スチューデントの t 検定による P 値を求めた。示すように単一の代表的な実験の結果を行った 3 回と同様の結果でこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: Lm マウスの感染します。6 匹のマウスのグループは、いずれか、野生型Lm (wt) の等量混合物に感染していたし、 Lm (ΔprfA) 系統または野生型Lmおよびハイパー病原性 (prfA *) 系統の等量混合物を減衰します。18 hpi マウスLmで肝臓の負担は CFU アッセイによって決定されました。この実験では、野生型Lmひずみには抗生物質感受性Lmの突然変異系統を区別することができます抗生物質耐性遺伝子が所有しています。マウスレバーされた両方の抗生物質含有メッキし、抗生物質自由な媒体および突然変異体と野生型のLmの比をプロットしました。点線は、感染している線量の変異/野生型比を表します。マウスの 2 つのコホートで野生型Lmの絶対レベル 12 と 15 の CFU/10⁶肝細胞であった。示すように単一の代表的な実験の結果実行されます 2 回と同様の結果に。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: Lm感染マウス肝の免疫応答します。マウスは、免疫および骨髄性特異的マーカーの発現のフローサイトメトリーによる分析した肝臓の 18 h 単一セル準備のためいずれかの感染や全身感染の 2 x 10 の⁵ CFU の gfp 発現するLm系統でした。細胞の割合 (A) 染色陽性特異的免疫細胞表面マーカー CD45 の⁺ 10⁶分離した合計ライブ肝細胞感染マウス、いずれかの野生型 (wt Lm) 感染マウスにあたり(ΔprfA) を減衰またはハイパー病原性 (prfA *) Lm系統。プロットはグループごとの 3 つのマウスの平均、スチューデントの t 検定による P 値を求めた。左のパネルに (B) を示されている個々 の感染していないマウス (上) と、個別wt Lm- 感染 (下); から細胞の肝臓の CD45 染色の染色のプロファイルは中央のパネルでは CD11b と F4/80、CD45 の骨髄性特異的マーカーの発現レベルを示す⁺のセル;右パネルには、指定されたゲートの細胞の Ly6C の発現レベルが表示されます。右端のパネルでは、Ly6C のオーバーレイを示す、CD11b の割合と平均蛍光強度 (MFI) を含む感染して感染したマウスから細胞の^{+ +} F4/80^-は示された Ly6C ゲートの肯定的な細胞します。表示はグループごとの 3 のマウスから代表的なマウスです。(C) Ly6C⁺感染および感染マウスの肝臓由来細胞 ((B) 記述されている中央と右のパネル) GFP 発現のフローサイトメトリーによる分析しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

その迅速かつプロセッシブ細胞感染プログラムLm感染に影響を与える細胞の活動を調査する理想的な病原体です。ホストの要因の数が肯定的または否定的に影響を与えるLm細胞感染^11,12,13,14に同定されています。2 つのような宿主因子研究室、パーフォリン 2 とヘム調節剤の特徴 (P2、こんにちは)、 Lmの感染過程の個別の機能を調節します。P2 欠損細胞はLmに非常に敏感、図 3のように、そしてこの高められた感受性はまた P2 ノックアウト マウス⁴の真実です。P2 表現と P2 欠損マクロファージの詳細な比較研究を示した後者のセルが強く酸性Lmを形成-病原性遺伝子発現を強化につながったファゴゾームを含みます。差分の病原性遺伝子発現が P2 欠損マクロファージの強化の感受性に貢献する仮説は、病原性の強いハイパー prfA *ひずみ、として前述のとおり、表現する病原性の発見によって支えられました。恒常高レベルで遺伝子は感染 P2 表現と P2 欠損マクロファージ⁴も同様します。したがって、超悪性のLmひずみの可用性の場合、P2 の宿主因子は否定的病原体病原性因子配置を調節すること仮説をテストを可能にしました。こんにちは、私たちはこのホストの要因が、感染した細胞から出現が制限されています。 Lmの細胞内輸送を調節することを示した、この細胞の活動は可能性が高いLm感染^15,16- 欠損マウスの高められた感受性のための基盤です。

感染症の数分以内に発生する細胞の活動を文書化する研究、こと彼らの共同培養、細菌と宿主細胞ない過度にさらされている温度変動やその他の環境が重要です。ストレス応答と重複 (混同) 感染で誘導される活動をアクティブに可能性がありますの条件。上記で説明した研究、感染を開始する直前にLmの処理時間を最小限に抑えとしてこのような一見単純なポイントが含まれます。たとえば、細菌培養を揺れ 37 ° C の定温器から取り外してし、ベンチの上に座っていること、(とりわけ) 温度と酸素の両方の可用性の変化はその後の初期の段階に影響を与える可能性があります適応をアクティブに宿主細胞との相互作用。同様に、宿主細胞がまた最初の感染応答に影響する可能性があります温度とメディアの変化に敏感です。実際にそれは不可能ですが、完全には、細菌のすべての変動を排除し、宿主細胞を可能な限り、それらを減らすことと標準的な営業計画、実験間の変化の条件を養殖を最小限に抑えられます。

これの重要性は過小評価も我々 の意見でする細胞感染モデルにおける抗生物質の使用は、追加変数です。ゲンタマイシンは、真核生物の細胞膜を比較的透過ではないために、しばしば選択の抗生物質です。古い現在の文献でそれは一般的に 50 μ G/ml で殺すために使用、すなわち細胞外 (内面化以外) 細菌。最近 25 μ G/ml に存在するとき、細胞内のLm¹⁷を殺すために真核生物の膜ゲンタマイシンの十分な拡散があることは直接実証されています。我々 の経験でゲンタマイシンのこのレベルを殺すLmすぐに接触、時にはるかに低いレベルで、2 に 5 μ g/mL の範囲殺すに対し > 99.9 %5 分の⁴未満でLm 。・ ローレンツと同僚は 25-50 μ G/ml の広く使われているゲンタマイシン濃度が十分に細胞内仮性結核菌を殺すためにまたこと示されている¹⁸。興味深いことに、このグループはまたその最適な条件を強調ゲンタマイシン透過型セルの組み合わせをホスト病原体ごとに決定されるべき細胞間のかなりの相違を示した。