Summary

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Abstract

İmmunohistokimyasal (IHC) yöntemleri protein ifade tarafından ışık mikroskobu in-situ analizi için araştırma ve teşhis amaçlı güçlü bir araç vardır. Ancak, görselleştirme ve miktar geleneksel chromogenic IHC kullanarak bir tek doku bölümünde birden çok antijenleri zorlu. Çoğaltılmış görüntü burada işaretleri karmaşık tümör microenvironment bağlamında yorumlanmalıdır lenfoma araştırma ve teşhis, özellikle alakalı olduğunu. Burada bir iletişim kuralı için birden çok hedef belirli hücre türleri lenfoma ilgi kantitatif değerlendirilmesi etkinleştirmek için boyama çoğaltılmış floresan IHC açıklar. Yöntem sunumunun antikor doğrulama, antikor optimizasyonu, lenfoma alt türlerinden işaretçileri olan optimizasyon multiplex, boyama doku Mikroarray (TMA) slayt ve slayt, tarama veri analizi, özel ile takip Lenfoma için başvuru. Bu yöntemi kullanarak, bir işaretleyici faiz ve yüzde pozitif her iki ortalama yoğunluğu için bir puan daha fazla Nicel analiz kolaylaştırmak için oluşturulur. Çoğullama örnek kullanımını en aza indirir ve ilgi her işaretçi için mekansal bilgi sağlar.

Introduction

Lenfoid neoplazmlar lenfositler tarafından malign kontrolsüz çoğalması kaynaklanır. Bu hücreler bağışıklık sisteminin önemli bileşenleri ve kemik iliği, lenf düğümleri, dalak ve diğer mukoza ilişkili lenfoid sistemi gibi birincil ve ikincil bağışıklık organlara localize. Lenfoid neoplazmlar morfoloji, immunophenotype, genetik özellikleri ve klinik sunum dahil olmak üzere özellikleri, bir takımyıldızı üzerinde göre sınıflandırılır bozuklukları heterojen bir grup vardır. Her parametre bir rol oynar, lineage bir belirleyici özelliği, kalır ve B hücreleri, T hücreleri ve doğal öldürücü (NK) hücreleri1elde neoplazmlar tanıyan WHO sınıflandırma sistemi temelini oluşturur.

Anahtar lenfoma sınıflandırılması için lökosit yüzey işaretleyicileri lenfositler2çeşitli alt türlerinden karşı antikor karakterizasyonu olmuştur. İmmünhistokimya (IHC) geleneksel olarak böyle işaretleri analiz için kullanılan ve ışık mikroskobu görüntülenmiştir hücre ve doku esaslı molekülleri algılamak için spesifik antijen-antikor tanıma prensibi temel alır 3. ancak, genellikle birden çok renk sinyalleri bir tek doku bölümünde güvenilir bir şekilde ayırt etmek zor olduğu için geleneksel alan parlak chromogenic multiplex IHC tarafından tek bir slayda birden çok hedef tanımlaması sınırlamaları vardır — özellikle bir çok düşük ifade4ile antijenleri için. Görsel değerlendirme ve boyama miktar da öznel, analiz ve veri yorumu5‘ te değişkenlik neden olabilir.

Bu nedenle, geleneksel IHC formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) örnekleri üzerinde aynı anda birden çok hedef lenfoma gibi immunologically çeşitli hastalıklarda tespiti için mümkün değildir. Ayrıca, çevredeki bağışıklık hücreleri neoplastik lenfositler ayırt kez imprecise. Bu lenfoma roman biyolojik alaka bakarak çalışmaları engeller. Bu bağlamda, multiplex floresan IHC (mf-IHC) antijen coexpression nicel bir değerlendirme sağlar ve mekansal ilişki sınırlı korunması ise daha yüksek hassasiyet ile6,örnekleri olarak umut verici bir alternatif sunuyor7. Bu görüntüleme teknolojisi dijital görüntü analiz yazılımı ile ortaklık, veri yorumu daha verimli hale ve tümör ve microenvironment heterojenlik8,9çalışma kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı yöntemi çoğullama tyramide tabanlı bir ayirt (Eğer) sinyali yükseltmek için uygulanır ve herhangi bir IHC doğrulanmış antikor türlerden herhangi bir ana bilgisayar, hatta aynı tür5,7 ‘ geliştirilen ile uyumludur , 10. tyramide tabanlı iletişim kuralı için fluorophore faiz dokuya doğrudan konjugasyon sağlar, böylece birden fazla lekeleri sıralı uygulama için izin önce her defasında, birincil ve ikincil antikor elimden antikor olan.

Çoğaltılmış bir strateji lenfomalarin bazilarinin varyant onların immünolojik desenleri ve hedefler belirleyerek teşhis ve tedavi sonuçları tahmin için faydalı olacaktır. Multiplex floresan IHC T ve B lenfosit işaretleri ve angioimmunoblastic T-Hücre Lenfomasi (AITL), T-foliküler yardımcı işaretleyicilerini bir panel incelenmesi için bizim laboratuvarında uygulanan alt türü olan periferik T Hücre Lenfomasi karakterize agresif tarafından klinik davranış ve tümör heterojenite11. Belgili tanımlık yarar bu yöntemin de nerede bir B-hücre reseptör eşzamanlı C-MYC ve BCL-2 ifadesi ile artan sinyal Bruton’ın Tirozin kinaz inhibisyon potansiyel terapötik kullanım öneriyor diffüz büyük B hücreli lenfoma içinde (DLBCL) resimli 12 .

Burada tüm antikor doğrulama kuralından seçime uygun denetim dokuların açıklamak ve lenfoma FFPE kullanarak çoğullama kurcalayarak lekeli slaytlar bir tarama kullanarak nihai bir analizini otomatik nicel patoloji görüntüleme sistem.

Protocol

Bu protokol için kullanılan tüm dokularda Singapur NHG etki alanı belirli İnceleme Kurulu B altında elde edilmiştir 2014/00693 çalışma. 1. seçimi ve doğrulama antikorların Not: herhangi bir çoğaltılmış paneli kurulması ile devam etmeden önce tüm antikorlar sağlam, yalnızca hedef antijen ilgi tanımlayan leke emin olun. Amacı özellikle doku bölümleri ilgi antijen tanıdınız antikorlar seçmektir. Pozitif ve negatif kontrol doku …

Representative Results

MF-IHC görüntüler için C-MYC ve BCL2 gen düzenlenmesi (çift-hit lenfoma) ile DLBCL örnek Şekil 1′ de gösterilmektedir. Şekil 2 simüle alan parlak immunohistokimyasal görüntüleri gösterir. Şekil 3 yüzde veri nesil gösterir. Şekil 4 nesil sayısal veri için Ortalama bir formül ayrıntılarını görüntüler. Şekil 5 angi…

Discussion

MF-IHC patologlar diagnosticcriteria içinde lenfoid patoloji rafine ve biyolojik belirli hücre tiplerinin klinik sonuç bir tahmin doğru olarak rolü çözümlemek için etkinleştirmek için potansiyele sahiptir. Yeni bir araştırma yöntemi olarak mf-IHC giderek tümör hücreleri17birden çok bağışıklık parametre nicel ve mekansal tanımlaması uygulanır. Mf-IHC tümör biyolojik ortak bir ifade için algılama tekrarlanabilir ve güvenilir5olmak gösterilmişt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.-B.N. ve A.D.J. Singapur Sağlık Bakanlığı’nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi geçiş ödüller tarafından (NMRC/TA/0020/2013 ve NMRC/TA/0052/2016) desteklenir. Yazarlar bir Yong Siew Yoon araştırma hibe Singapur Ulusal Üniversitesi Kanser Enstitüsü Vectra spektral görüntüleme mikroskop satın doğru gelen A.D.J. için kabul. Bu çalışmada Singapur NHG etki alanı belirli İnceleme Kurulu B tarafından onaylanmıştır (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
  4. Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

View Video