Summary

Мультиплексированных флуоресцентные иммуногистохимическое окрашивание, визуализации и анализа в гистологической образцы лимфомы

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

Здесь мы описываем протокол для мультиплекс флуоресцентные иммуногистохимическое окрашивание и изображений для одновременного локализации нескольких связанных рака антигенов в лимфомы. Этот протокол может быть продлен на colocalization анализ биомаркеров в всех разделах ткани.

Abstract

Иммуногистохимический (IHC) методы для in situ анализ выражения протеина, световой микроскопии являются мощным инструментом для исследовательских и диагностических целей. Однако визуализации и количественной оценки нескольких антигенов в разделе одной ткани с помощью обычных хромогенных IHC является сложной задачей. Мультиплексированных изображений является особенно актуальным в лимфома исследований и диагностики, где маркеры должны толковаться в контексте сложных опухоли микроокружения. Здесь мы описываем протокол для мультиплексных флуоресцентные IHC пятнать возможность количественной оценки несколько целевых объектов, в типах конкретных клеток интереса к лимфомы. Метод охватывает аспекты проверки антитела, антитела оптимизации, мультиплекс оптимизации с маркерами лимфомы подтипы, окрашивание ткани microarray (TMA) слайдов, и сканирование слайдов, а затем анализа данных, с конкретными Ссылка для лимфомы. С помощью этого метода, ноты для средней интенсивности маркером интерес и процент позитивность создаются для облегчения дальнейшего количественного анализа. Мультиплексирование минимизирует образец использования и обеспечивает пространственной информации, представляющей интерес для каждого маркера.

Introduction

Новообразования лимфоидной, вызванных бесконтрольного распространения злокачественного лимфоцитов. Эти клетки являются жизненно важными компонентами иммунной системы и локализации первичного и вторичного иммунных органов, например костного мозга, лимфатические узлы, селезенка и другие слизистой оболочки ассоциированной лимфоидной системы. Лимфоидных образований являются гетерогенной группы расстройств, которые классифицируются на основании созвездие функций, включая морфологии, иммунофенотип, генетические особенности и клинической картины. Хотя каждый параметр играет роль, линии остается определяющей чертой и формирует основу для системы классификации ВОЗ, которая признает новообразования, производные от клетки B, Т-клеток и естественных убийца (НК) клетки1.

Ключ к классификации лимфомы была характеристика антител против лейкоцита поверхностных маркеров различных подтипов лимфоцитов2. Иммуногистохимия (IHC) традиционно используется для анализа таких маркеров и основывается на принципе признания конкретных антиген антитело для обнаружения на основе клеток и тканей молекул, которые могут быть визуализированы через световой микроскоп 3. Однако, выявление нескольких целевых объектов на одном слайде, обычных ярко поле хромогенных мультиплекс IHC имеет ограничения, потому что это часто трудно отличить несколько сигналов цвет на участке одной ткани надежно — особенно для антигенов с очень низким выражение4. Также может быть субъективным, вызывая изменчивость в интерпретации анализа и данных5визуальной оценки и количественного определения окраски.

Таким образом обычные IHC на формалин исправлена, парафин врезанных образцов (FFPE) возможна не для одновременного обнаружения нескольких целей в иммунологически разнообразных заболеваний, как лимфома. Кроме того отличительный неопластических лимфоцитов из окружающих иммунные клетки часто является неточным. Это препятствует исследований, глядя на актуальность Роман биомаркеров в лимфомы. В этом контексте, мультиплекс флуоресцентные IHC (mf-IHC) предлагает перспективные альтернативы как позволяет количественной оценки ИССЛЕДОВАНИџ антигена и пространственные отношения с более высокой точностью при сохранении ограниченный образцы6,7. При этой технологии визуализации в партнерстве с программное обеспечение для анализа цифровых изображений, интерпретации данных производится более эффективным и облегчает исследование опухоли и микроокружения неоднородность8,9. В этом протоколе на основе tyramide иммунофлюоресценции (если) мультиплексирования метод применяется для усиления сигнала и совместим с любой ИГХ проверены антитела от любых видов хост, даже тех, которые разработаны в том же видов5,7 , 10. протокол на основе tyramide позволяет для прямого спряжение Флюорофор в ткани интерес так, что после каждого шага, позволяя для последовательного применения нескольких пятен могут быть лишены первичного и вторичного антитела без антитела перекрестной реактивности.

Мультиплексированных стратегия будет полезной для прогнозирования прогноз и лечение результатов путем определения целей и их вариант иммунологические закономерности в лимфом. Мультиплекс люминесцентные IHC был применен в нашей лаборатории для изучения группы маркеры лимфоцитов B и T и T-фолликулярная вспомогательные маркеры в angioimmunoblastic Т-клеточная лимфома (AITL), подтип периферической Т-клеточной лимфомы характеризуется агрессивным клинических поведение и опухоли неоднородность11. Полезность этого метода также иллюстрируется диффузный большой B-клеточной лимфомы (ККЛ), где увеличилась сигнализации B-клеточный рецептор с одновременным BCL-2 и C-MYC выражение предполагает потенциал терапевтического использования Брутон ингибирование киназы тирозина 12 .

Здесь мы описываем весь протокол от проверки антитела к выбору соответствующего управления тканей и мультиплексирование с помощью лимфома FFPE ткани, с возможного анализа окрашенных слайдов с помощью сканирования автоматизированных количественные патологии изображений системы.

Protocol

Все ткани, используемые в настоящем протоколе были получены под Сингапур NHG домена конкретного обзора Совет B изучение 2014/00693. 1. отбор и проверка антител Примечание: Прежде чем продолжить создание любой мультиплексированных группы, убедитесь, что все антите?…

Representative Results

MF-IHC изображения для ККЛ образца с C-MYC и BCL2 гена перестановка (двойной хит лимфомы) показано на рисунке 1. Рисунок 2 иллюстрирует имитируемых ярко поле иммуногистохимические изображений. Рисунок 3 показывает процент данны?…

Discussion

MF-IHC имеет потенциал для включения патологоанатомов для уточнения diagnosticcriteria в лимфоидных патологии и анализировать роль биомаркеров в типах конкретных клеток к предсказание клинических исходов. Как новый метод исследования mf-IHC все чаще применяется для количественного и пространстве…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Министерство здравоохранения Сингапура национальных медицинских исследований Совета переходного периода награды (NMRC/TA/0020/2013 и NMRC/TA/0052/2016) поддерживаются S.-б.н. и A.D.J.. Авторы признают Сью Ен Юн исследовательский грант A.D.J. из Национального института университета рака Сингапура к покупке спектральных тепловизионных микроскопом Vectra. Это исследование одобрено Сингапур NHG домена конкретного обзора Совет B (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
  4. Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

View Video