Summary

מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

כאן נתאר פרוטוקול עבור מולטיפלקס immunohistochemical פלורסנט מכתים והדמיה עבור ההתאמה סימולטני של אנטיגנים מרובים הקשורים לסרטן ב לימפומה. פרוטוקול זה ניתן להרחיב את הניתוח colocalization של סמנים ביולוגיים בתוך כל מקטעי רקמת.

Abstract

Immunohistochemical (IHC) שיטות לניתוח מקומיים של ביטוי חלבונים על ידי מיקרוסקופ אור הן כלי רב עוצמה עבור המחקר והן למטרות אבחון. עם זאת, ויזואליזציה של כימות של אנטיגנים מרובים במקטע בודד רקמות באמצעות IHC הדפסות כסף קונבנציונלי הוא מאתגר. הדמיה מרובבת רלוונטי במיוחד לימפומה מחקר, אבחון, שבו סמני צריך לפרש בהקשר של microenvironment הגידול מורכב. כאן נתאר פרוטוקול עבור מרובבת IHC פלורסנט מכתים כדי לאפשר את הערכה כמותית של מטרות מרובות סוגי תאים ספציפיים עניין בלימפומה. השיטה מכסה היבטים של נוגדן אימות, נוגדן אופטימיזציה, אופטימיזציה מולטיפלקס עם סמנים של סוגי לימפומה, צביעה של רקמת microarray (TMA) שקופיות ולאחר סריקה של השקופיות, ואחריו ניתוח נתונים, ספציפיות התייחסות לימפומה. באמצעות שיטה זו, הציונים של עוצמת בשני אכזרי של סמן של עניין את הגישה החיובית אחוז נוצרים כדי להקל עוד יותר על אנליזה כמותית. ריבוב ממזער מדגם ניצול ומספק מידע מרחבי עבור כל סמן עניין.

Introduction

Neoplasms הלימפה נגרמות על ידי מבוקרת ממאיר של לימפוציטים. תאים אלה הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, בתרגום לאיברים המערכת החיסונית ראשוני ומשני, כגון מח העצם, בלוטות הלימפה, טחול, מערכת הלימפה אחרים רירית הקשורים. Neoplasms הלימפה הם קבוצה הטרוגנית של הפרעות אשר מסווגים מבוסס על מערך של תכונות, כולל מורפולוגיה, immunophenotype, תכונות גנטיות של המצגת קליניים. בעוד כל פרמטר ממלא חלק, שושלת היוחסין נשאר המגדיר תכונה ו מהווה את הבסיס עבור מערכת סיווג WHO אשר מזהה neoplasms שמקורם בתאי B ותאי T, טבעי רוצח (NK) תאים1.

המפתח הסיווג של לימפומה כבר אפיון הנוגדנים נגד ליקוציט סמני פני השטח של תתי סוגים שונים של לימפוציטים2. אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לניתוח של סמנים כזה והיא מבוססת על העיקרון של ההכרה אנטיגן-נוגדן ספציפי כדי לזהות מולקולות תאים רקמות מבוססות להיות visualized באמצעות מיקרוסקופ אור 3. עם זאת, הזיהוי של מטרות מרובות בשקופית אחת מאת בהיר-שדות קונבנציונלי IHC מולטיפלקס הדפסות כסף יש מגבלות מאחר שלעיתים קשה להבחין אותות צבע מרובים על קטע רקמה אחת אמינה — במיוחד עבור אנטיגנים עם ביטוי נמוך4. הערכה חזותית כימות של צביעת ניתן גם סובייקטיבית, גורם השתנות ניתוח ונתונים לפרשנות5.

לכן, IHC המקובלת על דגימות (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע אינו ריאלי עבור גילוי סימולטני של מטרות מרובות במחלות immunologically מגוונות כמו לימפומה. יתר על כן, הבחנה לימפוציטים אמצעים מתאי מערכת החיסון שמסביב לעתים קרובות מדויק. זה מעכבת מחקרים מסתכל על הרלוונטיות של סמנים חדשניים לימפומה. בהקשר זה, IHC מולטיפלקס פלורסנט (mf-IHC) מציע חלופה מבטיח כמו זה מאפשר את הערכה כמותית של אנטיגן coexpression יחסים מרחביים עם דיוק גבוה יותר תוך שימור מוגבלת דגימות6,7. כאשר טכנולוגיית הדמיה זו היא שותפות עם התוכנה ניתוח תמונה דיגיטלי, פרשנות הנתונים מורכב יותר יעיל ואסטמה ומקילה על המחקר של הגידול, microenvironment הטרוגניות8,9. ב פרוטוקול זה, המבוסס על tyramide immunofluorescence (אם) שיטת ריבוב מוחל כדי להיקלט והוא תואם עם כל נוגדן IHC לאמת של כל מין המארח, אפילו אלה שפותחו ב-5,מינים באותו7 , 10. פרוטוקול מבוסס-tyramide מאפשר ההטיה ישירה של fluorophore לרקמות של הריבית כך נוגדן ראשוני ומשני ניתן הברקה לאחר כל שלב, המאפשרות יישום רציף של כתמים מרובים ללא נוגדנים אשיג.

אסטרטגיה מרובבת תהיה שימושית לניבוי תוצאות פרוגנוזה וטיפול על ידי זיהוי מטרות ודפוסי שלהם משתנה אוטואימונית ב לימפומות. מולטיפלקס פלורסנט IHC הוחל שלנו במעבדה לחקר פאנל של סמנים T ו- B לימפוציטים, סמני helper T-הזקיקים angioimmunoblastic T-cell לימפומה (AITL), תת סוג של לימפומה T-cell היקפיים מאופיין על ידי אגרסיבי קליני ההתנהגות ואת הגידול הטרוגניות11. השירות של שיטה זו מומחש גם ב- ‘ מאטום לשקוף ‘ B-cell לימפומה גדולים (DLBCL) איפה האיתות מוגברת של קולטן B-cell עם C-MYC סימולטני והביטוי BCL-2 מרמז על השימוש טיפולית פוטנציאל טירוזין קינאז עיכוב של ברוטון 12 .

כאן נתאר פרוטוקול כולו של נוגדן אימות לבחירה של רקמות הפקד המתאים ואת ריבוב באמצעות לימפומה FFPE רקמות, עם ניתוח בסופו של דבר של ויטראז’ים השקופיות באמצעות סריקה של כלים אוטומטיים הפתולוגיה הכמותית הדמיה מערכת.

Protocol

לכל רקמות בשימוש פרוטוקול זה התקבלו תחת סינגפור NHG תחום ספציפי סקירה לוח B ללמוד 2014/00693. 1. בחירת ובדיקת נוגדנים הערה: לפני שתמשיך עם הממסד של חלונית מרובבת, ודא כי נוגדנים כל כתם robustly, זיהוי רק היעד אנטיגן עניין. המטרה היא לבחור נוגדנים במיוחד מזהה אנטיגן עניין בס…

Representative Results

mf-IHC תמונות עבור מדגם DLBCL עם C-MYC ו שחלוף ג’ין BCL2 (כפול פגע לימפומה) מוצגים באיור1. איור 2 מדגים את התמונות immunohistochemical בהיר-שדה מדומה. איור 3 מציין את הדור של הנתונים באחוזים. איור 4 מציג את הפרטים של נוסחה החציוני ?…

Discussion

mf-IHC יש הפוטנציאל לאפשר פתולוגים לעידון diagnosticcriteria בפתולוגיה הלימפה, כדי לנתח את התפקיד של סמנים ביולוגיים סוגי תאים ספציפיים לכיוון חיזוי של התוצאה הקלינית. כשיטת מחקר חדש, mf-IHC מוחלת יותר ויותר על הזיהוי המרחבי וסטטיסטי של פרמטרים מרובים המערכת החיסונית של תאי הגידול17. הגילו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ס-תרגוםאולפני ו- A.D.J. נתמכים על ידי נבחרת רפואי מחקר מועצת המעבר פרסים של סינגפור משרד הבריאות (NMRC/ת א/0020/2013 ו- NMRC/ת א/0052/2016). המחברים לאשר מענק מחקר יונג יון Siew כדי A.D.J. מ באוניברסיטה הלאומית סרטן המכון של סינגפור לקראת רכישת מיקרוסקופ הדמיה ספקטרלי וקטרה. מחקר זה אושרה על ידי סינגפור NHG תחום ספציפי סקירה לוח B (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
  4. Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

View Video