Summary

La coloración de Immunohistochemical fluorescente multiplexado, por imágenes y análisis en muestras histológicas de linfoma

Published: January 09, 2019
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Summary

Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.

Abstract

Métodos de inmunohistoquímica (IHC) para el análisis in situ de la expresión de la proteína por microscopia ligera son una poderosa herramienta de investigación y diagnóstico. Sin embargo, la visualización y cuantificación de antígenos múltiples en una sección de tejido solo usando IHC cromogénico convencional es un reto. Proyección de imagen de multiplexado es especialmente relevante en linfoma investigación y diagnóstico, donde los marcadores tienen que interpretarse en el contexto de un microambiente tumoral compleja. Aquí se describe un protocolo para IHC fluorescente multiplexado tinción para posibilitar la evaluación cuantitativa de múltiples objetivos en tipos celulares específicos de interés en el linfoma. El método cubre aspectos de validación de anticuerpo, anticuerpo optimización, la optimización multiplex con marcadores de subtipos de linfoma, la tinción de tejido microarrays (TMA) y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con específicas referencia a linfoma. Usando este método, partituras de la intensidad media de un marcador de interés y el porcentaje de positividad se generan para facilitar aún más el análisis cuantitativo. Multiplexación minimiza la utilización de la muestra y proporciona información espacial para cada marcador de interés.

Introduction

Neoplasias linfoides son causados por la incontrolada proliferación maligna de linfocitos. Estas células son componentes vitales del sistema inmune y localización a los órganos inmunes primarios y secundarios, como la médula ósea, ganglios linfáticos, bazo y otros sistema linfoide asociado a mucosa. Neoplasias linfoides son un grupo heterogéneo de trastornos que se clasifican basados en una constelación de características, incluyendo la morfología, immunophenotype, características genéticas y la presentación clínica. Mientras que cada parámetro desempeña un papel, sigue siendo una característica que define y constituye la base para el sistema de clasificación de la OMS que reconoce neoplasias derivadas de células B, células T y natural killer (NK) las células1.

Clave para la clasificación del linfoma ha sido la caracterización de los anticuerpos contra marcadores de superficie de leucocitos de los diversos subtipos de linfocitos2. Inmunohistoquímica (IHQ) se ha utilizado tradicionalmente para el análisis de estos marcadores y se basa en el principio del reconocimiento antígeno-anticuerpo específico para detectar moléculas basado en células y tejidos que pueden visualizarse con el microscopio de luz 3. sin embargo, la identificación de objetivos múltiples en una sola diapositiva por IHC multiplex cromogénico convencional de campo brillante tiene limitaciones porque a menudo es difícil distinguir múltiples señales de color en una sección de tejido único fiable — especialmente para los antígenos con una expresión muy baja de4. Evaluación visual y cuantificación de la coloración también pueden ser subjetivas, provocando variabilidad en la interpretación de datos y análisis5.

Por lo tanto, IHC convencional en las muestras (FFPE) formalina-fijos, parafina-encajado no es factible para la detección simultánea de múltiples objetivos en contra diversas enfermedades como el linfoma. Por otra parte, distinguir los linfocitos neoplásticos de las células inmunes circundantes es a menudo imprecisa. Esto impide estudios que la relevancia de nuevos biomarcadores en el linfoma. En este contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) ofrece una alternativa prometedora que permite la evaluación cuantitativa de coexpression de antígeno y una relación espacial con mayor precisión mientras que la conservación limitada de las muestras6,7. Cuando esta tecnología está asociada con el software de análisis digital de imágenes, la interpretación de los datos es más eficiente y facilita el estudio del tumor y microambiente heterogeneidad8,9. En el presente Protocolo, una base de tyramide inmunofluorescencia (IF) método de multiplexación se aplica para amplificar la señal y es compatible con cualquier anticuerpo IHC-validado de cualquier especie, incluso los desarrollados en la misma especie5,7 , 10. el protocolo de tyramide permite la conjugación directa del fluoróforo al tejido de interés para que el anticuerpo primario y secundario puede ser despojado después de cada paso, permitiendo la aplicación secuencial de múltiples manchas sin reactividad cruzada del anticuerpo.

Una estrategia de multiplexado será útil para predecir el pronóstico y el tratamiento de los resultados mediante la identificación de objetivos y sus variante patrones inmunológicos en linfomas. MULTIPLEX fluorescente IHC se ha aplicado en nuestro laboratorio para el estudio de un panel de marcadores T y linfocitos B y T-folicular ayudante en linfoma angioimmunoblastic T-cell (AITL), un subtipo de linfoma T-cell periférico caracterizado por agresivas clínica comportamiento y tumor heterogeneidad11. La utilidad de este método se ilustra también en linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) donde la mayor señalización de un receptor de células B con expresión simultánea de C-MYC y BCL-2 sugiere el posible uso terapéutico de la inhibición de la cinasa de tirosina de Bruton 12 .

Aquí describimos el conjunto del Protocolo de validación del anticuerpo a la selección de tejidos de control apropiado y multiplexación usando linfoma FFPE tejidos, con un eventual análisis de diapositivas manchadas, utilizando un análisis automatizado de imágenes de patología cuantitativa sistema.

Protocol

Todos los tejidos utilizados en este protocolo se obtuvieron bajo el B Singapur NHG dominio específico de tablero de estudio 2014/00693. 1. selección y validación de los anticuerpos Nota: Antes de proceder con el establecimiento de cualquier panel multiplexado, asegúrese de que todos los anticuerpos de la mancha enérgicamente, identificar sólo el antígeno blanco de interés. El objetivo es seleccionar anticuerpos que reconocen específicamente el antígeno de i…

Representative Results

MF-IHC imágenes una muestra de DLBCL con C-MYC y el cambio de gene de BCL2 (doble golpe linfoma) se muestran en la figura 1. La figura 2 ilustra las imágenes simuladas campo brillante de immunohistochemical. Figura 3 indica la generación de datos de porcentaje. Figura 4 muestra los detalles de una fórmula mediana para la generación de datos numéricos. <strong class…

Discussion

MF-IHC tiene el potencial para permitir que los patólogos perfeccionando diagnosticcriteria en patología linfoide y analizar el papel de los biomarcadores en tipos específicos de la célula hacia una predicción del resultado clínico. Como un nuevo método de investigación, mf-IHC se aplica cada vez más a la identificación cuantitativa y espacial de múltiples parámetros inmunes de las células de tumor17. La detección de mf-IHC de la coexpresión de marcadores biológicos de tumor ha dem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.-B.N. y A.D.J. son apoyados por el médicos investigación Consejo transición premios de Ministerio de salud Singapur nacionales (NMRC/TA/0020/2013 y NMRC/TA/0052/2016). Los autores reconocen una beca de investigación Yoon Yong Siew a A.D.J. de la Universidad Nacional cáncer Institute de Singapur hacia la compra de un microscopio de proyección de imagen espectral de Vectra. Este estudio es aprobado por el Singapur NHG dominio específico de Junta B (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

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Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

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