Summary

Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.

Abstract

Immunohistochemische (IHC) methoden voor de analyse van de in-situ van eiwit expressie door de lichte microscopie is een krachtig hulpmiddel voor zowel onderzoek en diagnostische doeleinden. Echter is de visualisatie en de kwantificering van meerdere antigenen in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele chromogenic IHC uitdagend. Multiplexed imaging is vooral relevant in lymfoom onderzoek en diagnostiek, waar markeringen moeten worden geïnterpreteerd in de context van een complexe tumor communicatie. Hier beschrijven we een protocol voor multiplexed fluorescerende IHC kleuring zodat de kwantitatieve beoordeling van meerdere doelen in specifieke celtypen belangstelling lymfoom. De methode omvat aspecten van validatie van antilichaam, antilichaam optimalisatie, de multiplex optimalisatie met markeringen van lymfoom subtypen, de kleuring van weefsel microarray (TMA) dia’s en het scannen van dia’s, gevolgd door data-analyse, met specifieke verwijzing naar lymfoom. Met behulp van deze methode, worden scores voor zowel het gemiddelde intensiteit van een marker van belang en het percentage positiviteit gegenereerd om verdere kwantitatieve analyse. Multiplexing minimaliseert monster benutting en ruimtelijke informatie voor iedere markeerdraad van belang.

Introduction

Lymfoïde gezwellen worden veroorzaakt door de ongecontroleerde kwaadaardige proliferatie van lymfocyten. Deze cellen zijn essentiële componenten van het immuunsysteem en lokaliseren naar de primaire en secundaire immuun organen, zoals het beenmerg, lymfeklieren, milt en andere mucosa-geassocieerde lymfoïde systeem. Lymfoïde gezwellen zijn een heterogene groep van stoornissen die worden geclassificeerd gebaseerd op een constellatie van functies, waaronder morfologie, immunophenotype, genetische kenmerken, en klinische presentatie. Terwijl elke parameter een rol speelt, afkomst blijft een kenmerkend en vormt de basis voor de WHO classificatiesysteem die gezwellen afgeleid van natural killer (NK) cellen1, B-cellen en T-cellen herkent.

Sleutel tot de classificatie van lymfoom is de karakterisatie van de antilichamen tegen leukocyten oppervlakte merkers van de verschillende subtypen van lymfocyten2. Immunohistochemistry (IHC) heeft van oudsher wordt gebruikt voor de analyse van deze markers en is gebaseerd op het beginsel van de erkenning van de specifieke antigeen-antilichaam aan de cel – en weefsel-gebaseerde moleculen die kunnen worden gevisualiseerd door de lichte Microscoop detecteren 3. de identificatie van meerdere doelen voor een enkele dia door conventionele helder-veld chromogenic multiplex IHC heeft echter beperkingen omdat het vaak moeilijk te onderscheiden van meerdere signalen van de kleur op een enkele weefselsectie betrouwbaar — met name voor antigenen met een zeer lage expressie4. Visuele beoordeling en kwantificering van kleuring kunnen ook subjectief, variabiliteit veroorzaakt in de analyse en data interpretatie5.

Conventionele IHC op monsters van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) dus niet haalbaar voor de simultane detectie van meerdere doelen in via het immuunsysteem veroorzaakte uiteenlopende ziekten zoals lymfoom. Bovendien is het vaak onnauwkeurig neoplastische lymfocyten van de omliggende immuuncellen onderscheid te maken. Dit belemmert de studies te kijken naar de relevantie van nieuwe biomarkers in lymfoom. In dit verband, multiplex fluorescerende IHC (mf-IHC) biedt een veelbelovend alternatief als hierdoor de kwantitatieve beoordeling van antigeen coexpression en een ruimtelijke relatie met hogere precisie terwijl het behoud van de beperkte monsters6,7. Wanneer deze imaging technologie is een partnerschap aangegaan met de software van de analyse van de digitale beelden, de data interpretatie bestaat efficiënter en vergemakkelijkt de studie van de tumor en communicatie heterogeniteit8,9. In dit protocol, een tyramide gebaseerde immunofluorescentie (IF) Multiplex methode wordt toegepast op het signaal versterken en is compatibel met elke IHC-gevalideerde antilichaam van elke soort die host, zelfs die zijn ontwikkeld in de dezelfde soort5,7 , 10. de tyramide-gebaseerd protocol voorziet in de directe Woordherkomst en-opbouw van de fluorophore aan het weefsel van belang zodat de primaire en secundaire antilichaam kan worden gestript na elke stap, waardoor de sequentiële toepassing van meerdere vlekken zonder antilichaam Kruisallergie.

Een multiplexed strategie zal zitten nuttig voor het voorspellen van de resultaten van de prognose en behandeling door het identificeren van doelstellingen en hun variant immunologische patronen in lymfomen. Multiplex TL IHC is toegepast in ons lab voor de studie van een panel van T en B-lymfocyt markers en T-folliculaire helper markeringen in angioimmunoblastic T-cel lymfoom (AITL), een subtype van een perifere T-cel lymfoom gekenmerkt door agressieve klinische gedrag en tumor heterogeniteit11. Het nut van deze methode wordt ook geïllustreerd in diffuus grote B-cel lymfoom (DLBCL) waar de toegenomen signalering van een B-cel receptor met gelijktijdige C-MYC en BCL-2 uitdrukking het potentiële therapeutische gebruik van Bruton van tyrosine kinase remming suggereert 12 .

Hier beschrijven we het gehele protocol van antilichaam validatie bij de selectie van passende controlemaatregelen weefsels en multiplex met behulp van lymfoom FFPE weefsels, met een eventuele analyse van gebeitst dia’s met behulp van een standaardscanoptie geautomatiseerde kwantitatieve pathologie imaging systeem.

Protocol

Alle weefsels in dit protocol gebruikt werden verkregen onder de Singapore NHG domein specifieke Review Board B 2014/00693 studie. 1. selectie en validatie van antilichamen Opmerking: Voordat u verdergaat met de instelling van een multiplexed panel, zorgen dat alle antilichamen vlek krachtig, identificeren van alleen de doel-antigeen van belang. Het doel is het selecteren van antilichamen die specifiek het antigeen van belang in weefselsecties wordt herkend. <…

Representative Results

MF-IHC beelden voor een DLBCL monster met C-MYC en BCL2 gen omlegging (dubbel-hit lymfoom) worden weergegeven in Figuur 1. Figuur 2 illustreert de gesimuleerde helder-veld immunohistochemische beelden. Figuur 3 geeft de generatie van percentage gegevens. Figuur 4 geeft de details van een mediane formule voor de generatie van numerieke gegevens. Figuu…

Discussion

MF-IHC heeft het potentieel om pathologen verfijnen diagnosticcriteria lymfoïde pathologie en analyseren van de rol van biomarkers in specifieke celtypen richting een voorspelling van klinische resultaten. Als een nieuwe onderzoeksmethode, wordt mf-IHC steeds meer toegepast op de kwantitatieve en ruimtelijke identificatie van meerdere immuun parameters van tumor cellen17. De detectie van mf-IHC voor de co expressie van tumor biomarkers gebleken reproduceerbaar zijn en betrouwbare<sup class="xref"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.-B.N. en A.D.J. worden ondersteund door de Singapore ministerie van volksgezondheid nationale medische onderzoek Raad overgang Awards (NMRC/TA/0020/2013 en NMRC/TA/0052/2016). De auteurs erkennen een onderzoeksbeurs van Yong Siew Yoon aan A.D.J. van de nationale universiteit kanker instituut van Singapore naar de aankoop van een Vectra spectrale imaging Microscoop. Deze studie is goedgekeurd door de Singapore NHG domein specifieke Review Board B (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
  4. Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

View Video