Summary

Coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada, imagem e análise de amostras histológicas de linfoma

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

Aqui descrevemos um protocolo para multiplex immunohistochemical fluorescente de coloração e de imagem para localização simultânea de múltiplos antígenos associada a câncer de linfoma. Este protocolo pode ser estendido para a análise de colocalization de biomarcadores dentro de todas as secções de tecido.

Abstract

Métodos de imuno-histoquímica (IHC) para a análise in situ da expressão da proteína por microscopia de luz são uma ferramenta poderosa para fins de diagnóstico e pesquisa. No entanto, a visualização e a quantificação de vários antígenos em uma seção de tecido único usando IHC cromogênico convencional é um desafio. Imagem multiplexada é especialmente relevante na investigação de linfoma e diagnósticos, onde marcadores tem que ser interpretada no contexto de um microambiente do tumor complexo. Aqui descrevemos um protocolo para multiplexado IHC fluorescente coloração para permitir a avaliação quantitativa de alvos múltiplos em tipos de células específicas de interesse do linfoma. O método abrange os aspectos de validação de anticorpo, otimização de anticorpo, a otimização multiplex com marcadores de subtipos de linfoma, a coloração de lâminas de tecido microarray (TMA) e a digitalização de slides, seguido de análise de dados, com específicas referência para o linfoma. Usando esse método, partituras para ambos a intensidade média de um marcador de interesse e a percentagem de positividade são geradas para facilitar ainda mais a análise quantitativa. Multiplexação minimiza a utilização da amostra e fornece informação espacial para cada marcador de interesse.

Introduction

Neoplasias linfoides são causadas pela proliferação descontrolada de linfócitos maligna. Estas células são componentes vitais do sistema imunológico e localizar nos órgãos imunes primárias e secundárias, tais como a medula óssea, linfonodos, baço e outro sistema linfoide associado a mucosa. Neoplasias linfoides são um grupo heterogêneo de desordens que são classificados com base em uma constelação de características, incluindo morfologia, imunofenótipo, apresentação clínica e características genéticas. Enquanto cada parâmetro desempenha um papel, linhagem continua a ser uma característica definidora e constitui a base para o sistema de classificação do WHO que reconhece neoplasias derivadas de células B, células T e natural killer (NK) células1.

Chave para a classificação de linfoma foi a caracterização dos anticorpos contra marcadores de superfície dos leucócitos dos vários subtipos de linfócitos2. Imuno-histoquímica (IHC) tem sido tradicionalmente utilizado para a análise de tais marcadores e baseia-se no princípio do reconhecimento do antígeno-anticorpo específico para detectar moléculas baseadas em células e tecidos que podem ser visualizadas através do microscópio de luz 3. no entanto, a identificação de alvos múltiplos em um único slide por convencional brilhante-campo cromogênico multiplex IHC tem limitações porque muitas vezes é difícil distinguir vários sinais de cor em uma seção de tecido único confiável — especialmente para os antígenos com uma expressão muito baixo4. Avaliação visual e quantificação de coloração também podem ser subjetivas, causando a variabilidade na interpretação de dados e análise5.

Portanto, IHC convencional em amostras de formalin-fixas, parafina (FFPE) não é viável para a detecção simultânea de múltiplos alvos em imunologicamente diversas doenças como o linfoma. Além disso, distinguir linfócitos neoplásicos das células imunes circundantes é muitas vezes imprecisa. Isto dificulta estudos olhando a relevância de novos biomarcadores em linfoma. Neste contexto, IHC fluorescente multiplex (mf-IHC) oferece uma alternativa promissora como permite a avaliação quantitativa coexpression antígeno e uma relação espacial com maior precisão, preservando a limitada amostras6,7. Quando esta tecnologia de imagem é uma parceria com o software de análise de imagem digital, a interpretação dos dados é feita mais eficiente e facilita o estudo de tumor e microambiente heterogeneidade8,9. Neste protocolo, a imunofluorescência baseada em tyramide (IF) multiplexação método é aplicada para amplificar o sinal e é compatível com qualquer anticorpo IHC validados de qualquer espécie de hospedeiro, mesmo aqueles desenvolvidos na mesma espécie5,7 , 10. o protocolo baseado em tyramide permite a conjugação direta do fluoróforo no tecido de interesse para que o anticorpo primário e secundário pode ser desnudado após cada etapa, permitindo a aplicação sequencial de múltiplas manchas sem reactividade cruzada do anticorpo.

Uma estratégia multiplexada será útil para prever resultados de prognóstico e tratamento através da identificação de alvos e seus padrões variante imunológicas em linfomas. Multiplex fluorescente IHC tem sido aplicado em nosso laboratório para o estudo de um painel de marcadores de T e de linfócitos B e T-folicular marcadores de auxiliar em angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL), um subtipo de um linfoma de células T periférico caracterizada por agressivo clínico comportamento e tumor heterogeneidade11. A utilidade desse método é também ilustrada em difusa linfoma de células B grande (DLBCL), onde o aumento de sinalização de um receptor de células B com expressão de C-MYC e BCL-2 simultânea sugere o uso terapêutico potencial de inibição de quinase de tirosina de Bruton 12 .

Aqui descrevemos o protocolo inteiro da validação de anticorpo para a seleção dos tecidos de controle apropriado e multiplexação usando linfoma FFPE tecidos, com uma eventual análise das lâminas coradas usando uma varredura automatizada de imagem patologia quantitativa sistema.

Protocol

Todos os tecidos utilizados neste protocolo foram obtidos sob o B Singapore NHG domínio específico Review Board estudar 00693/2014. 1. seleção e validação de anticorpos Nota: Antes de prosseguir com a criação de qualquer painel multiplexada, certifique-se que todos os anticorpos mancham robustamente, identificando apenas o antígeno alvo de interesse. O objectivo é seleccionar os anticorpos que reconhecem especificamente o antígeno de interesse em secções …

Representative Results

MF-IHC imagens para uma amostra DLBCL com C-MYC e rearranjo de gene BCL2 (dobro-bata linfoma) são mostradas na Figura 1. A Figura 2 ilustra as imagens simulada brilhante-campo imuno-histoquímica. Figura 3 indica a geração de dados de porcentagem. Figura 4 exibe os detalhes de uma fórmula mediano para a geração de dados numéricos. A Figura 5</…

Discussion

MF-IHC tem o potencial para permitir que os patologistas para refinar diagnosticcriteria em patologia linfoide e analisar o papel dos biomarcadores em tipos de células específicas em direção a uma previsão de resultados clínicos. Como um novo método de investigação, mf-IHC é cada vez mais aplicado à identificação de vários parâmetros imunes de células de tumor17quantitativa e espacial. A detecção de mf-IHC para a expressão co de biomarcadores de tumor mostrou ser confiável e re…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.-B.N. e A.D.J. são suportados pelo Medical Research Conselho transição prêmios do Ministério da saúde a Singapore nacionais (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Os autores reconhecem uma bolsa de investigação de Yoon Siew Yong para A.D.J. partir da Universidade Nacional Cancer Institute de Cingapura para a compra de um microscópio de imagem espectral de Vectra. Este estudo é aprovado pela B Singapore NHG domínio específico Review Board (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

  1. Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. , (2017).
  2. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  3. Dabbs, D. J. . Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applications. , (2010).
  4. Kim, S. -. W., Roh, J., Park, C. -. S. Immunohistochemistry for Pathologists: Protocols, Pitfalls, and Tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
  5. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  6. Anderson, M. W., Natkunam, Y., Jones, D. Immunohistochemical profiling of lymphoma. Neoplastic Hematopathology: Experimental and Clinical Approaches. , 21-44 (2010).
  7. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).
  8. Cregger, M., Berger, A. J., Rimm, D. L. Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 130 (7), 1026-1030 (2006).
  9. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  10. Tóth, Z. E., Mezey, &. #. 2. 0. 1. ;. Simultaneous Visualization of Multiple Antigens with Tyramide Signal Amplification using Antibodies from the same Species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  11. Ng, S. -. B., et al. Quantitative Analysis of a Multiplexed Immunofluorescence Panel in T-Cell Lymphoma. SLAS TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation. 23 (3), 252-258 (2017).
  12. Bogusz, A. M., et al. Diffuse large B-cell lymphoma with concurrent high MYC and BCL2 expression shows evidence of active B-cell receptor signaling by quantitative immunofluorescence. PLoS One. 12 (2), e0172364 (2017).
  13. Kalyuzhny, A. E. . Signal Transduction Immunohistochemistry: Methods and Protocols. , (2011).
  14. Bordeaux, J., et al. Antibody validation. BioTechniques. 48 (3), 197-209 (2010).
  15. PerkinElmer. . Vectra 3 Quantitative Pathology Imaging System User’s Manual. , (2012).
  16. Ho, J., Tumkaya, T., Aryal, S., Choi, H., Claridge-Chang, A. Moving beyond P values: Everyday data analysis with estimation plots. bioRxiv. , (2018).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. The Journal of Immunology Author Choice. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  18. PerkinElmer. . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

View Video