Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Cellulaire eiwitten kunnen worden onderverdeeld in twee klassen: die membranen en die niet zijn gekoppeld. Non-membraan geassocieerde eiwitten worden aangetroffen in het cytosol, nucleoplasm en lumina van organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER). Er zijn twee klassen van membraan-geassocieerde eiwitten, integraal en perifere. Integraal membraaneiwitten zijn ook bekend als transmembraan eiwitten, omdat een of meer segmenten van de polypeptide keten omvat het membraan, meestal als een α-helix samengesteld uit hydrofobe aminozuren. Transmembraan eiwitten zijn co-translationally ingevoegd membranen in de loop van hun biosynthese en zo geconfigureerd blijven totdat zij zijn catabolized. Perifere membraaneiwitten zijn subsidiair naar membranen, meestal als gevolg van posttranslationele wijziging met hydrofobe moleculen zoals lipiden gereden. In tegenstelling tot integraal membraaneiwitten, de vereniging van perifere membraaneiwitten met cellulaire membranen is omkeerbaar en kan worden geregeld. Vele perifere membraan eiwitten functie in signaalroutes en gereglementeerde vereniging met een membraan is een mechanisme voor activeren of remming van een traject. Een voorbeeld van een signalering molecuul thats een perifere membraan eiwit is de kleine GTPase, RAS. Na een reeks van posttranslationele modificaties die wijziging met een lipide farnesyl, de gewijzigde C-terminus van een volwassen RAS-eiwit wordt ingevoegd in de cytoplasmatische bijsluiter van het cellulaire membraan. Het plasma-membraan is met name waar het RAS zijn downstream effector RAF1 bezighoudt. Om te voorkomen dat een constitutief activering van mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) traject, zijn meerdere niveaus van controle van RAS. Naast rendering RAS inactief door hydrolyseerd GTP in BBP, kan actieve RAS ook worden gelost van het plasma-membraan door wijzigingen of interacties met solubilizing factoren om te remmen signalering. Hoewel fluorescerende levende imaging cel biologen de gelegenheid biedt te observeren de subcellular localisatie van fluorescente proteïne-gelabeld perifere membraan eiwitten¹, blijft er een kritische noodzaak om te evalueren van de membraan vereniging van endogene eiwitten semi-kwantitatief met eenvoudige biochemische benaderingen.

De juiste biochemische evaluatie van eiwit verdeling tussen membraan en oplosbare breuken is kritisch afhankelijk van twee factoren: cellulaire homogenisering en efficiënte scheiding van membraan en oplosbare breuken. Hoewel sommige protocollen, met inbegrip van de meest gebruikte gecommercialiseerd kits, is afhankelijk van wasmiddel gebaseerde cel homogenisering, kunnen deze methoden analyse verduisteren door winning van membraaneiwitten in oplosbare fase². Dienovereenkomstig, niet-wasmiddel op basis, mechanische methoden van verstoring van de cel schonere resultaten opleveren. Er zijn verschillende methoden van mechanische verstoring van cellen gekweekt in cultuur of geoogst van bloed of organen. Het gaat hierbij om Dounce homogenisering, verstoring van de fijne naald, kogellager homogenisering, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie. Hier wij stikstof cavitatie te evalueren en te vergelijken met andere methoden. Stikstof cavitatie is afhankelijk van stikstof, dat wordt ontbonden in het cytoplasma van de cellen onder hoge druk. Na evenwichtsinstelling, wordt de celsuspensie abrupt blootgesteld aan atmosferische druk zodanig dat stikstof belletjes worden gevormd in het cytoplasma die traan open de cel als gevolg van hun bruisen. Als de druk voldoende hoog is, stikstof bruisen de kern³ kan verstoren en membraan gebonden organellen zoals lysosomen⁴. Echter, als de druk laag genoeg wordt gehouden, zal de decompressie verstoren het plasmamembraan en ER maar niet andere organellen, waardoor het morsen van zowel cytosol en intact cytoplasmatische organellen in het homogenaat die de cavitate⁵is aangewezen. Om deze reden is stikstof cavitatie de methode van keuze voor het isoleren van organellen zoals lysosomen- en mitochondriën.

Het is echter ook een uitstekende manier voor te bereiden op een homogenaat die gemakkelijk kan worden gescheiden in membraan en oplosbare breuken. Het drukvat (voortaan “de bom” genoemd) gebruikt tijdens cavitatie bestaat uit een dikke roestvast stalen behuizing die hoge druk, met een inham voor levering van de stikstofgas uit een tank en een retourzijde met een verstelbare spoelafsluiter doorstaat.

Stikstof cavitatie is gebruikt voor de cel homogenisering sinds de jaren 1960-⁶. In 1961 vestigde Hunter en Commerfold⁷ stikstof Cavitatie als een haalbare optie voor verstoring van de zoogdieren weefsel. Sindsdien onderzoekers hebben de techniek om de verschillende cellen en weefsels met succes, en aangepast stikstof cavitatie is uitgegroeid tot een nietje in meerdere toepassingen, waaronder membraan voorbereiding^8,9, kernen en organel voorbereiding^10,11, en onstabiele biochemische extractie. Op dit moment cel biologen vaker andere methoden gebruiken van cel homogenisering omdat de voordelen van stikstof homogenisering hebben niet veel geadverteerd, stikstof bommen duur zijn en er is een misvatting dat een relatief groot aantal cellen Vereist. Protocollen voor stikstof cavitatie tot cel-vrije homogenates met intact kernen niet zijn gepubliceerd, en in de meest gepubliceerde evaluaties volumes van 20 mL celsuspensie werden gebruikt. Aan te passen deze klassieke techniek te passen aan de huidige eisen van het werken met kleinschalige monsters, presenteren we een gewijzigde protocol van stikstof cavitatie speciaal ontworpen voor gekweekte cellen. Na stikstof cavitatie, het homogenaat wordt gescheiden in oplosbare (S) en membraan (P) breuken door differentiële centrifugeren, eerst met een lage snelheid spin kernen en ongebroken cellen te verwijderen, en vervolgens met een snelle spin (> 100.000 x g) om te scheiden membranen van de oplosbare fractie. Wij de efficiëntie van de scheiding met immunoblots analyseren en vergelijken van stikstof cavitatie met andere verstoring van de mechanische technieken. We onderzoeken ook de osmotische werking van homogenisering buffer tijdens stikstof cavitatie.