קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור ללא דטרגנט המגון בתרבית תאים בתרבית של מבוסס על חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מאוגד על-ידי ultracentrifugation. שיטה זו היא אידיאלית עבור ניטור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים ושברים ממברנה.
Abstract
תאים בתרבית שימושיים ללימוד ההתפלגות subcellular של חלבונים, כולל ממברנה פריפריאלי חלבונים. גנטית מקודד fluorescently חלבונים מתויג מהפכה בחקר התפלגות חלבון subcellular. עם זאת, קשה לכמת את ההתפלגות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, במיוחד כאשר חלבונים הם cytosolic חלקית. יתר על כן, חשוב תדירות ללמוד חלבונים אנדוגני. מבחני ביוכימיים כגון immunoblots נשארים תקן הזהב על כימות של חלבון הפצה אחרי subcellular fractionation. למרות שיש קיטים מסחריים שואפים לבודד cytosolic או שברים קרום מסוימים, רוב ערכות אלה מבוססים על חילוץ עם דטרגנטים, אשר עשויים להיות מתאימים ללמוד חלבוני ממברנה פריפריאלי בקלות שחולצו מן ממברנות. כאן אנו מציגים עבור הסלולר המגון פרוטוקול ללא חומרי ניקוי על-ידי חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מכורך מאת ultracentrifugation. אנחנו לאשר את ההפרדה של organelles subcellular ב מסיסים ושברים גלולה בכל סוגי התאים, והשווה חלבון החילוץ בין מספר שיטות מקובלות שאינן מבוססות על חומרי ניקוי המגון מכני. בין מספר יתרונות של חנקן קוויטציה הוא יעילות מעולה של שיבוש הסלולר עם מינימום נזק פיזי וכימי organelles עדין. בשילוב עם ultracentrifugation, חנקן קוויטציה זו שיטה מצוינת לבחון את השינוי של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין cytosolic ושברים ממברנה.
Introduction
החלבונים ניתן לחלק לשתי קבוצות: אלה המשויכות ממברנות ואלה שאינם. Non-הממברנה חלבונים הקשורים נמצאים ציטוזול, נוקלאופלזמה, לומינה של organelles כגון תוך-פלזמית (ER). ישנם שני סוגים של חלבונים הקשורים ממברנה, נפרד ואת היקפי. חלבוני ממברנלי אינטגרלי מכונים גם חלבונים transmembrane כי אחד או יותר חלקי פוליפפטיד משתרע על הקרום, בדרך כלל בתור מורכב של חומצות אמינו הידרופוביות סליל α. חלבונים transmembrane co-translationally מוכנסים לתוך ממברנות במהלך ביוסינטזה שלהם ולהישאר שתצורתו נקבעה כל כך עד שהם אינם catabolized. חלבוני ממברנה פריפריאלי מונעים בגיחות לממברנות, בדרך כלל בעקבות השינוי post-translational עם מולקולות הידרופוביות כגון שומנים. בניגוד ממברנלי אינטגרלי חלבונים, השיוך של חלבוני ממברנה פריפריאלי ממברנות הסלולר הוא הפיך, יכול להיות מוסדר. פונקציית חלבוני ממברנה פריפריאלי רבים איתות המסלולים וחופש ההתאגדות מוסדר עם ממברנות הוא אחד למנגנון הפעלה או מעכבים שביל. דוגמה אחת של מולקולה איתות הוא חלבון ממברנה פריפריאלי היא GTPase קטן, ראס. לאחר סדרה של שינויים post-translational הכוללות שינוי עם ליפופרוטאין farnesyl, מוסיף ששונה קרבוקסילי של חלבון RAS בוגרת העלעל cytoplasmic של הממברנה התאית. באופן ספציפי, קרום פלזמה היא איפה RAS עוסקת שלה אפקטור במורד הזרם RAF1. כדי למנוע הפעלה המכונן של חלבון מופעל mitogen קינאז (MAPK) מסלול, מספר רמות של שליטה של ראס נמצאים במקום. חוץ עיבוד ראס לא פעיל על-ידי hydrolyzing GTP ל- GDP, ראס הפעיל גם יכול להשתחרר מן קרום פלזמה על-ידי שינויים או אינטראקציות עם solubilizing גורמים כדי לעכב איתות. למרות פלורסנט הדמיה חיה מעניקה תא ביולוגים את ההזדמנות כדי לבחון את ההתאמה subcellular של חלבוני ממברנה פריפריאלי מתויג החלבון הניאון1, נותר צורך קריטי כדי להעריך את קרום התאחדות חלבונים אנדוגני באופן כמותי למחצה עם גישות ביוכימיים פשוטים.
הערכת הביוכימי נאות חלבון מחיצות בין קרום ושברים מסיס הוא ביקורתי תלויה בשני גורמים: המגון הסלולר והפרדה יעיל של קרום ושברים מסיסים. למרות פרוטוקולים מסוימים, כולל ערכות ממוסחר הנפוצה ביותר, תלוי המגון תא מבוססי דטרגנט, שיטות אלה ניתן לערפל ניתוח על-ידי חילוץ קרום חלבונים לתוך מסיסים שלב2. בהתאם לכך, שיטות המבוסס, מכני ללא חומרי לשבירת תאים לספק תוצאות הניקוי. ישנן מספר שיטות של שיבוש מכני של תאים גדלו בתרבות או שנקטפו דם או איברים. אלה כוללים דאונס המגון, הפרעה מחט בסדר, המגון תנודה, sonication קוויטציה חנקן. כאן נוכל להעריך חנקן קוויטציה להשוות אותו בשיטות אחרות. חנקן קוויטציה מסתמך על חנקן אשר התפרקה בציטופלסמה של התאים בלחצים גבוהים. לאחר equilibration, התליה תא חשוף בפתאומיות הלחץ האטמוספרי כך נוצרות בועות חנקן בציטופלסמה זה כשהבנו את התא כתוצאה בתסיסת שלהם. אם הלחץ הוא מספיק גבוה, חנקן בתסיסת יכול לשבש את גרעין3 , ממברנה מאוגדים organelles כמו lysosomes4. עם זאת, אם הלחץ נשמרת נמוכה מספיק, הלחץ ישבש קרום פלזמה ו אר אבל לא organelles אחרים, ובכך לשפוך ציטוזול והן organelles cytoplasmic בשלמותם לתוך homogenate המיועד cavitate5. מסיבה זו, חנקן קוויטציה היא השיטה של בחירה עבור בידוד organelles כמו lysosomes והמיטוכונדריה.
עם זאת, זה גם דרך מצוינת של הכנת homogenate כי ניתן להפריד בקלות לתוך קרום ושברים מסיסים. הספינה לחץ (נקרא מעתה ואילך “הפצצה”) ששימש קוויטציה מורכב מעטפת פלדה אל חלד עבה זה עומד בלחץ גבוה, עם מעין שקע בחופו עבור משלוח של הגז חנקן טנק ויציאת שקע עם שסתום פריקה מתכוונן.
חנקן קוויטציה שימש עבור תא המגון מאז שנות ה-606. בשנת 1961, צייד ו Commerfold7 נוסדה קוויטציה חנקן כמו אפשרות מעשית עבור רקמות יונקים השיבוש. מאז, חוקרים יש להתאים את הטכניקה כדי תאים ורקמות שונים עם הצלחה, חנקן קוויטציה הפך למרכיב ביישומים מרובים, כולל ממברנה הכנה8,9, גרעין, אברון הכנה10,11, חילוץ הביוכימי יציב. כעת, ביולוגים תא לעתים קרובות יותר להעסיק בשיטות אחרות של התא המגון כי היתרונות של חנקן המגון יש לא היה נרחב מפורסם, פצצות חנקן יקרים יש תפיסה מוטעית זו מספר גדול יחסית של תאים נדרש. פורסמו הפרוטוקולים עבור חנקן קוויטציה להשגת homogenates נטול תאים עם גרעינים שלמים, הערכות שפורסמו ביותר שימשו כרכים של 20 מ”ל של התא השעיה. להסתגל טכניקה קלאסית זו כדי להתאים לדרישות הנוכחי של עבודה עם דוגמאות בקנה מידה קטן, אנו מציגים פרוטוקול שונה של חנקן קוויטציה שתוכננה במיוחד עבור תאים בתרבית. לאחר קוויטציה חנקן, homogenate מחולק מסיסים (S) ושברים ממברנה (P) על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, תחילה עם ספין במהירות נמוכה כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה, ולאחר מכן עם ספין במהירות גבוהה (> g 100,000 x) כדי להפריד בין ממברנות של השבר מסיסים. לנו לנתח את יעילותו של ההפרדה עם immunoblots ולהשוות קוויטציה חנקן עם טכניקות טיפול נוספות שיבושים מכניים. אנחנו גם osmotic חיקרו את השפעת העלאת מאגר המגון במהלך קוויטציה חנקן.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרונות של חנקן קוויטציה על פני שיטות אחרות של שיבוש מכני הן מגוונות. אולי היתרון המשמעותי ביותר הוא היכולת שלה בעדינות אך ביעילות homogenize דגימות. העקרונות הפיזי של דגימות מתקרר הלחץ במקום ביצירת הנזק חימום מקומי כמו אולטרה סאונד, חיכוך/הטיה המבוסס על טכניקות. קוויטציה הוא גם יעיל מאוד-שיב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי GM055279, CA116034 ו- CA163489.
Materials
| Cell Disruption Vessel (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Nitrogen cavitation Bomb |
| Dounce homogenizer (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Dounce pestle and tube |
| U-100 Insulin Syringe 28G½ | Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 antibody | Santa Cruz | 271688 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-actin antibody | Santa Cruz | 47778 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| β-tubulin antibody | DSHB | E7-s | Mouse antibody, use at 1:5000 dilution |
| Calnexin antibody | Santa Cruz | 23954 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Calregulin antibody | Santa Cruz | 373863 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Catalase antibody | Santa Cruz | 271803 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| CIMPR antibody | Abcam | 124767 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| EEA1 antibody | Santa Cruz | 137130 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| EGFR antibody | Santa Cruz | 373746 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F0-ATPase antibody | Santa Cruz | 514419 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| F1-ATPase antibody | Santa Cruz | 55597 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Fibrillarin antibody | Santa Cruz | 374022 | Mouse antibody, use at 1:200 dilution |
| Golgin 97 antibody | Santa Cruz | 59820 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| HDAC1 antibody | Santa Cruz | 81598 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Hexokinase 1 antibody | Cell Signaling Technology | 2024S | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Lamin A/C antibody | Santa Cruz | 376248 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| LAMP1 antibody | DSHB | H4A3-c | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Na+/K+ ATPase antibody | Santa Cruz | 48345 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab7 antibody | Abcam | 137029 | Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution |
| Rab9 antibody | Thermo | MA3-067 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RCAS1 antibody | Santa Cruz | 398052 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| RhoGDI antibody | Santa Cruz | 360 | Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution |
| Ribosomal protein S6 antibody | Santa Cruz | 74459 | Mouse antibody, use at 1:1000 dilution |
| Sec61a antibody | Santa Cruz | 12322 | Goat antibody, use at 1:1000 dilution |
| Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 349622 | Sample tube for ultracentrifugation |
| TLK-100.3 rotor | Beckman Coulter | 349481 | rotor for ultracentrifugation |
| Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifuge |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11697498001 | protease inhibitors |
| Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade | Corning | 353089 | large cell scraper |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro stir bar |
| Ceramic-Top Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | S504501AS | magnetic stirrer |
References
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
- Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
- Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
- Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
- Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
- Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
- Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
- Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
- Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
- Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
- Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
- Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
- Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
- Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
- Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
- Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
- Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
- Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).
