Кавитация азота и дифференциального центрифугирования позволяет для контроля за распределением периферийных мембранных белков в культивируемых клеток

Клетчатые протеины можно разделить на два класса: те, которые связаны с мембраны и те, которые не являются. Non мембранных белков и связанные находятся в цитозоле, нуклеоплазмы и lumina органеллы например эндоплазменный ретикулум (ER). Существует два класса связанный мембранами белков, неотъемлемой и периферийных устройств. Неотъемлемой мембранных белков, также известный как трансмембранные белки, потому что один или несколько сегментов цепи полипептида охватывает мембраны, как правило в α-спирали состоит из гидрофобных аминокислот. Трансмембранные белки co-translationally вставляются в мембраны в ходе их биосинтез и остаются так настроен до тех пор, пока они являются голодании. Периферические мембранных белков вынуждены вторично мембраны, обычно вследствие столб-поступательные изменения с гидрофобные молекулы, такие как липиды. В отличие от составной мембранных белков Ассоциация периферийных мембранных белков с клеточных мембран является обратимым и может регулироваться. Многие функции белков периферийных мембраны в сигнальных путей и регулируемых ассоциацией с мембран является одним из механизмов для активации или препятствующих путь. Одним из примеров сигнальной молекулы, что периферической мембранный белок является небольшой ГТФазы, ран. После серии столб-поступательные изменения, которые включают модификации с Фарнезилпирофосфат липидов изменение C-конечная зрелой белок RAS вставляет в цитоплазматических листовка клеточной мембраны. В частности плазматической мембраны является, где ран занимается ее течению эффекторных RAF1. Чтобы предотвратить учредительный активации Митоген активированный протеин киназы (MAPK) пути, несколько уровней управления РАН находятся на месте. Кроме предоставляемых РАН неактивных гидроизолирующей GTP в ВВП, активные РАН также могут быть освобождены от плазматической мембраны путем изменения или взаимодействия с растворяющие факторы для подавления сигналов. Хотя флуоресцентные живых изображений дает клеточных биологов возможность наблюдать за субцеллюлярные локализации флуоресцентный протеин тегами периферийных мембранные белки¹, остается крайне необходимо оценить мембраны ассоциации эндогенные белки полу количественно с простой биохимических подходов.

Надлежащей оценки биохимических белка перегородки между мембраной и растворимых фракций зависит от двух факторов: сотовой гомогенизации и эффективное разделение мембраны и растворимых фракций. Хотя некоторые протоколы, включая наиболее широко используемых коммерциализированной наборы, зависят от гомогенизации ячейки на основе моющих средств, эти методы могут запутывать анализа путем извлечения мембранных белков в растворимые фаза². Соответственно без моющих средств на основе, механические методы разрушения клеток предоставляют результаты уборщика. Существует несколько методов механического разрушения клеток выросли в культуре или заготавливаемым из крови или органов. К ним относятся Dounce гомогенизации, нарушения тонкой иглой, -подшипник гомогенизации, sonication и азота кавитации. Здесь мы оцениваем азота кавитации и сравнить его с другими методами. Кавитация азота зависит от азота, растворенных в цитоплазме клеток под высоким давлением. После уравновешивания суспензию клеток резко подвергается воздействию атмосферного давления таким образом, что в цитоплазме, разорвать клеток вследствие их вскипания образуются пузырьки азота. Если давление является достаточно высоким, пузырьков азота может нарушить ядра³ и мембраной связаны органеллы как лизосомы⁴. Однако если давление сохраняется достаточно низкий, декомпрессия нарушит плазматической мембраны и ER, но не другие органеллы, тем самым разлив цитозоле и нетронутыми цитоплазматических органелл в огневки, который обозначается cavitate⁵. По этой причине кавитации азота является методом выбора для изоляции как лизосом и митохондрии органеллы.

Однако это также отличный способ подготовки огневки, который может быть легко разделена на мембраны и растворимых фракций. Сосуд под давлением (отныне называется «бомба») используется в процессе кавитации состоит из корпуса из нержавеющей стали толщиной, выдерживает высокое давление, с входом для доставки газ азот из танка и напорный канал с регулируемой разгрузочный клапан.

Кавитация азота был использован для гомогенизации клеток начиная с 1960-х⁶. В 1961 году Хантер и Commerfold⁷ создана кавитации азота как жизнеспособный вариант для млекопитающих тканей срыв. С тех пор исследователи приспособились технику для различных клеток и тканей с успехом, и азота кавитации стал штапель в нескольких приложениях, включая мембраны подготовка^8,9, ядер и органелл Подготовка^10,11и лабильных биохимических добычи. В настоящее время клеточных биологов чаще используют другие методы клеток гомогенизации, потому что преимущества азота гомогенизации широко не объявлена, бомбы азота являются дорогостоящими и есть заблуждение, что относительно большое количество клеток Обязательно. Протоколы для кавитации азота для достижения свободных клеток гомогенатах с нетронутыми ядра не были опубликованы, и в наиболее опубликованных оценок использовались объемы 20 мл суспензии клеток. Чтобы адаптировать этот классический метод для удовлетворения текущих требований работы с небольших образцов, мы представляем измененный Протокол азота кавитации, специально предназначенные для культивируемых клеток. После азота кавитации, огневки разделяется на водорастворимые (S) и мембранные (P) фракции, дифференциального центрифугирования, сначала с низкой скорости отжима для удаления ядра и нерушимой клетки, а затем с высокоскоростным вращением (> 100 000 x g) для разделения мембраны из растворимых фракции. Мы анализируем эффективность разделения с иммуноблотов и сравните азота кавитации с другими методами механического нарушения. Мы также расследовать осмотического эффекта гомогенизации буфера во время азота кавитации.