Summary

L'isolamento e arricchimento di fegato progenitrici sottoinsiemi identificati da un marcatore combinazione romanzo di superficie

Published: February 18, 2017
doi:

Summary

lesioni al fegato sono accompagnate da espansione di cellule progenitrici che rappresenta una popolazione cellulare eterogenea. Classificazione Novel di questo compartimento cellulare consente di distintivo più sottoinsiemi. Il metodo qui descritto illustra l'analisi citofluorimetrica ed elevato isolamento purezza vari sottogruppi che possono essere utilizzati per ulteriori analisi.

Abstract

Durante lesioni croniche del fegato, cellule progenitrici espandono in un processo chiamato reazione duttulare, che comporta anche la comparsa di infiltrato cellulare infiammatorio e l'attivazione delle cellule epiteliali. La popolazione di cellule progenitrici durante tali reazioni infiammatorie è stato per lo più studiata utilizzando marcatori di superficie singoli, sia per l'analisi istologica o con tecniche di citometria a base di flusso. Tuttavia, nuovi marcatori di superficie identificati vari sottoinsiemi funzionalmente distinte all'interno del progenitore di fegato / stelo vano cella. Il metodo presentato qui descrive l'isolamento e il flusso dettagliata analisi di citometria di sottoinsiemi progenitrici utilizzando combinazioni marcatori romanzo di superficie. Inoltre, dimostra come i vari sottogruppi di cellule progenitrici possono essere isolati con metodi di elevata purezza con modalità automatizzate magnetico e FACS ordinamento-based. Importante, novel ed enzimatica semplificato dissociazione del fegato consente l'isolamento di queste popolazioni cellulari rare con un'alta redditivitàche è superiore rispetto ad altri metodi esistenti. Questo è particolarmente rilevante per studiare ulteriormente cellule progenitrici in vitro o per isolare l'RNA di alta qualità per analizzare il profilo di espressione genica.

Introduction

la rigenerazione del fegato è principalmente associato con la capacità di auto-rinnovamento degli epatociti. Tuttavia, le lesioni croniche del fegato si verificano con l'attivazione delle cellule progenitrici e di espansione, che sono stati associati con la loro capacità di differenziarsi in epatociti e colangiociti 1, 2, 3, 4. Questo è particolarmente rilevante in quanto, durante lesioni croniche, epatociti proliferazione non è efficace. Nonostante diversi studi di tracciabilità genetica di targeting cellule progenitrici, il loro ruolo nella rigenerazione del fegato rimane controverso 5, 6, 7, 8. Inoltre, l'attivazione delle cellule progenitrici è stato collegato ad un aumento della risposta fibrotica nel fegato, che solleva domande sul loro ruolo esatto durante lesioni 9, 10.

La natura eterogenea del compartimento di cellule progenitrici è stato a lungo suggerito da studi di espressione genica che isolate cellule progenitrici che esprimono un unico marcatore di superficie utilizzando microdissezione o cella metodi basati su di smistamento 1, 11. Infatti, di recente, una nuova combinazione marcatore superficie con gp38 (podoplanin) inequivocabilmente legata precedenti marcatori singoli di cellule progenitrici di vari sottoinsiemi 12. È importante sottolineare che questi sottoinsiemi non solo differivano nella loro espressione marcatore di superficie, ma anche esposte le alterazioni funzionali durante ferite 12.

Molteplici modelli animali sono stati utilizzati per studiare l'attivazione delle cellule progenitrici e la rigenerazione del fegato. Sembra che i vari tipi di lesioni promuovere l'attivazione di diversi sottoinsiemi di cellule progenitrici 12. Questo potrebbe spiegare il phdivergenza enotypic della reazione duttulare osservato negli esseri umani 4. Così, i complessi fenotipiche e funzionali analisi di cellule progenitrici sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella infortuni e il vero significato della reazione duttulare in malattie del fegato.

Oltre combinazioni marcatore di superficie, le differenze cruciali nei protocolli isolamento delle cellule complicano ulteriormente le conclusioni sulla base di studi precedenti 2. Una notevole quantità di studi affrontato il ruolo delle cellule progenitrici che notevolmente differiscono per il protocollo di isolamento (ad esempio, dissociazione fegato (combinazione enzima e durata del processo), media densità, e la velocità di centrifugazione) 2. Una tecnica di isolamento ottimizzato, fornendo una migliore sopravvivenza per le popolazioni di cellule rare e riflessivo della composizione sottoinsieme, è stato sviluppato e pubblicato di recente 12. Lo scopo di questo articolo è di fornire una più detprotocollo soffriva esattamente di questa procedura di isolamento delle cellule del fegato e il sottoinsieme di analisi per consentire la corretta riproduzione della tecnica. Inoltre, il protocollo include un confronto con il metodo di isolamento precedente per dimostrare le differenze rispetto al nuovo protocollo.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte con l'approvazione dei comitati di etica e cura degli animali di Homburg University Medical Center. 1. Preparazione dei Materiali e tamponi Appena preparare tutti i buffer necessari per la digestione fegato utilizzando componenti sterili e una cappa laminare per evitare la contaminazione batterica. Preparare il tampone di raccolta (CB) mescolando 49,5 ml di terreno RPMI e 0,5 ml di siero bovino fetale (FBS, bassa en…

Representative Results

La procedura qui presentata per la digestione del fegato utilizzando una nuova miscela di enzimi risultati in una cella singola sospensione contenente parenchimali e le cellule epatiche non parenchimali (Figure 1 e 2a). Dopo l'ACK-lisi dei globuli rossi, il flusso diretto analisi di citometria di cella singola sospensione è possibile (figure 1 e 2). La strategia di gating comporta l'esclusione di doppietti e cel…

Discussion

Infiammazione del fegato e lesioni di diversa origine innescano processi rigenerativi del fegato che sono accompagnati da espansione di cellule progenitrici e l'attivazione 2, 3. Queste cellule progenitrici epatiche possiedono staminali caratteristiche cellulari e probabilmente svolgono un ruolo significativo nel meccanismo patogenetico di varie malattie del fegato.

L'eterogeneità delle cellule progenitrici epatiche è stato…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt Sofja Kovalevskaja premio per VLK.

Materials

RPMI Life Technologies 21875-034
phenol red free DMEM Life Technologies 31053-028
FBS Life Technologies 10270-106
Collagenase P Sigma-Aldrich 11249002001
DNAse-I Sigma-Aldrich 10104159001
Dispase Life Technologies 17105041
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01
HBSS Life Technologies 14025-050
PBS Sigma-Aldrich D8537
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 Prepare 1 % stock solution
10 % BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM Sigma-Aldrich D1145
counting Beads Count Bright Life Technologies C36950
PI Miltenyi Biotec 130-093-233
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
anti-CD31 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-097-418
anti-CD45 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485
CD64 Purified BioLegend 139302 Dilution: 1:100
CD16/32 Purified BioLegend 101302 Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7 BioLegend 103116 Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin BioLegend 102504 Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified Bio-Techne AF2755-SP Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC BioLegend 127410 Dilution: 1:1400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin BioLegend 127404 Dilution: 1:1400
CD133 PE Miltenyi Biotec 130-102-210 use 3 µl, marks progenitor cells
CD133 Biotin BioLegend 141206 Dilution: 1:100
CD34 Biotin eBioScience 13-0341-81 Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue BioLegend 140306 Dilution: 1:800
CD157 PE BioLegend 140203 Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421 BioLegend 118225 Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin Miltenyi Biotec 130-101-885 use 10 µl
Mouse IgG2b, κ PE BioLegend 400311
Rat IgG1 PE BioLegend 400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 BioLegend 400624
Rat IgG2a, κ Biotin BioLegend 400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 BioLegend 400535
Syrian Hamster IgG APC BioLegend 402012
Syrian Hamster IgG Biotin BioLegend 402004
Normal Goat IgG Control Purified Bio-Techne AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11055 Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405 Life Technologies S32351 Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh A. Hartenstein PAS3
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
FACS AriaTMIII BD Biosciences
FACSDiva sofware BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube Falcon 352063
Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT lysis buffer is included

References

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

Play Video

Cite This Article
Julich-Haertel, H., Tiwari, M., Mehrfeld, C., Krause, E., Kornek, M., Lukacs-Kornek, V. Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination. J. Vis. Exp. (120), e55284, doi:10.3791/55284 (2017).

View Video