Summary

Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

Published: February 18, 2017
doi:

Summary

lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.

Abstract

Pendant les blessures chroniques du foie, les cellules progénitrices se développer dans un processus appelé réaction canalaire, ce qui implique également l'apparition de infiltrat cellulaire inflammatoire et l'activation des cellules épithéliales. La population de cellules souches au cours de telles réactions inflammatoires a surtout été étudié en utilisant des marqueurs de surface uniques, soit par une analyse histologique ou par des techniques à base de cytométrie en flux. Cependant, de nouveaux marqueurs de surface identifiés divers sous-ensembles fonctionnellement distinctes au sein de l'ancêtre du foie / tige compartiment cellulaire. La méthode présentée ici décrit l'isolement et organigramme détaillé cytométrie analyse des sous-ensembles progénitrices en utilisant des combinaisons de marqueurs roman de surface. En outre, il montre comment les différents sous-ensembles de cellules progénitrices peuvent être isolés par des méthodes de tri de haute pureté en utilisant automatisé magnétique et FACS. Surtout, nouveau et simplifié dissociation enzymatique du foie permet l'isolement de ces populations de cellules rares avec une viabilité élevéequi est supérieure en comparaison avec d'autres méthodes existantes. Ceci est particulièrement pertinent pour étudier davantage les cellules progénitrices in vitro ou pour l' isolement de l' ARN de haute qualité pour analyser le profil d'expression génique.

Introduction

La régénération hépatique est principalement associée à la capacité d'auto-renouvellement des hépatocytes. Néanmoins, les lésions chroniques du foie se produisent avec l' activation des cellules progénitrices et l' expansion, qui ont été associés à leur capacité à se différencier en hépatocytes et cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Ceci est particulièrement pertinent parce que, au cours des blessures chroniques, la prolifération des hépatocytes est pas efficace. En dépit de nombreuses études de traçage génétique ciblant les cellules souches, leur rôle dans la régénération du foie reste controversée 5, 6, 7, 8. En outre, l'activation des cellules progénitrices a été liée à une augmentation de la réponse fibrotique dans le foie, ce qui soulève des questions quant à leur rôle exact pendant 9 blessures, 10.

Le caractère hétérogène du compartiment de cellules progénitrices a longtemps été suggérée par des études d'expression génique , qui isole des cellules progénitrices exprimant un marqueur de surface unique en utilisant une microdissection ou une cellule méthodes basées sur le tri 1, 11. En effet, tout récemment, une nouvelle combinaison de marqueurs de surface à l' aide gp38 (podoplanin) lié sans équivoque des marqueurs individuels précédents de progéniteurs de 12 différents sous – ensembles. Surtout, ces sous – ensembles non seulement diffèrent par leur expression de marqueurs de surface , mais aussi présentaient des altérations fonctionnelles pendant 12 blessures.

Plusieurs modèles animaux ont été utilisés pour étudier l'activation des cellules progénitrices et la régénération du foie. Il semble que les différents types de blessures favorisent l'activation des sous – ensembles de cellules souches 12 différentes. Cela pourrait expliquer le phdivergence enotypic de la réaction ductulaire observée chez les humains 4. Ainsi, les analyses phénotypiques et fonctionnels complexes de cellules progénitrices sont essentiels pour comprendre leur rôle dans les blessures et la vraie signification de la réaction canalaire dans les maladies du foie.

Outre les combinaisons de marqueurs de surface, les différences cruciales dans les protocoles d'isolement de cellules compliquent encore davantage les conclusions fondées sur des études antérieures 2. Une quantité importante d'études a évoqué le rôle des cellules progénitrices qui diffèrent grandement dans leur protocole d'isolement (par exemple, la dissociation du foie (combinaison de l' enzyme et la durée du processus), de densité moyenne, et la vitesse de centrifugation) 2. Une technique d'isolation optimisée, offrant une meilleure viabilité des populations de cellules rares et de réflexion de la composition du sous – ensemble, a été développé et publié récemment 12. Le but de cet article est de fournir un plus detailed protocole de la procédure d'isolement des cellules du foie et de l'analyse du sous-ensemble pour permettre une bonne reproduction de la technique. En outre, le protocole comprend une comparaison avec la méthode d'isolement préalable pour démontrer les différences par rapport au nouveau protocole.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été menées avec l'approbation des comités d'éthique et de soins aux animaux de University Medical Center Homburg. 1. Préparation des matériaux et Tampons Fraîchement préparer tous les tampons nécessaires à la digestion du foie en utilisant des composants stériles et une hotte laminaire pour éviter toute contamination bactérienne. Préparer le tampon de collecte (CB) en mélangeant 49,5 ml de milieu RPMI et …

Representative Results

La procédure présentée ici pour la digestion du foie en utilisant un nouveau mélange d'enzymes conduit à une suspension unicellulaire contenant parenchymateuses et les cellules hépatiques non parenchymateuses (figures 1 et 2a). Après la lyse ACK des globules rouges, l'écoulement direct de l' analyse par cytométrie la suspension à cellule unique est possible (figures 1 et 2). La stratégie de déclen…

Discussion

Inflammation du foie et des blessures de différentes origines déclenchent les processus de régénération du foie qui sont accompagnés par l' expansion des cellules progénitrices et activation 2, 3. Ces cellules progénitrices hépatiques possèdent souches caractéristiques cellulaires et jouent probablement un rôle important dans le mécanisme pathogénique de diverses maladies du foie.

L'hétérogénéité des progé…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation Sofja Kovalevskaja Award Alexander von Humboldt à VLK.

Materials

RPMI Life Technologies 21875-034
phenol red free DMEM Life Technologies 31053-028
FBS Life Technologies 10270-106
Collagenase P Sigma-Aldrich 11249002001
DNAse-I Sigma-Aldrich 10104159001
Dispase Life Technologies 17105041
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01
HBSS Life Technologies 14025-050
PBS Sigma-Aldrich D8537
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002 Prepare 1 % stock solution
10 % BSA Miltenyi Biotec 130-091-376
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM Sigma-Aldrich D1145
counting Beads Count Bright Life Technologies C36950
PI Miltenyi Biotec 130-093-233
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec 130-092-575
anti-CD31 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-097-418
anti-CD45 MicroBeads Miltenyi Biotec 130-052-301
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485
CD64 Purified BioLegend 139302 Dilution: 1:100
CD16/32 Purified BioLegend 101302 Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7 BioLegend 103116 Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin BioLegend 102504 Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified Bio-Techne AF2755-SP Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC BioLegend 127410 Dilution: 1:1400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin BioLegend 127404 Dilution: 1:1400
CD133 PE Miltenyi Biotec 130-102-210 use 3 µl, marks progenitor cells
CD133 Biotin BioLegend 141206 Dilution: 1:100
CD34 Biotin eBioScience 13-0341-81 Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue BioLegend 140306 Dilution: 1:800
CD157 PE BioLegend 140203 Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421 BioLegend 118225 Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin Miltenyi Biotec 130-101-885 use 10 µl
Mouse IgG2b, κ PE BioLegend 400311
Rat IgG1 PE BioLegend 400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 BioLegend 400624
Rat IgG2a, κ Biotin BioLegend 400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 BioLegend 400535
Syrian Hamster IgG APC BioLegend 402012
Syrian Hamster IgG Biotin BioLegend 402004
Normal Goat IgG Control Purified Bio-Techne AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11055 Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405 Life Technologies S32351 Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh A. Hartenstein PAS3
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACS separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
FACS AriaTMIII BD Biosciences
FACSDiva sofware BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube Falcon 352063
Rneasy plus mini kit Qiagen 74134 RLT lysis buffer is included

References

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Cite This Article
Julich-Haertel, H., Tiwari, M., Mehrfeld, C., Krause, E., Kornek, M., Lukacs-Kornek, V. Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination. J. Vis. Exp. (120), e55284, doi:10.3791/55284 (2017).

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