Isolatie en Verrijking van Liver Progenitor subsets geïdentificeerd door een Novel Surface Marker Combinatie
Summary
Lever verwondingen worden begeleid door voorlopercellen cel expansie die een heterogene populatie cellen vertegenwoordigt. Nieuwe indeling van deze cellulaire compartiment zorgt voor de onderscheidende meerdere subsets. De hier beschreven methode laat de flowcytometrieanalyse en hoge zuiverheid isoleren van diverse subsets die kunnen worden gebruikt voor verdere tests.
Abstract
Tijdens chronische lever verwondingen, progenitorcellen breiden in een proces genaamd ductulaire reactie, die ook betrekking heeft op de weergave van inflammatoire cellulaire infiltraat en epitheliale cel activatie. De populatie voorlopercellen gedurende deze ontstekingsreacties is meestal onderzocht middels enkel oppervlak markers, door histologische analyse of met flowcytometrie-gebaseerde technieken. Echter, nieuwe oppervlak markers geïdentificeerd verschillende functioneel verschillende subgroepen binnen de lever voorloper / stamcel compartiment. De hier gepresenteerde methode beschrijft de isolatie en gedetailleerd flowcytometrie analyse van voorlopercellen subsets door middel van nieuwe oppervlak marker combinaties. Bovendien toont hoe de verschillende voorlopercel deelverzamelingen kunnen worden geïsoleerd met hoge zuiverheid met behulp van geautomatiseerde magnetische en FACS sortering-gebaseerde methoden. Belangrijker nieuwe en vereenvoudigde enzymatische dissociatie van de lever maakt de isolatie van deze zeldzame celpopulaties met een hoge levensvatbaarheiddie superieur in vergelijking met andere bestaande methodes. Dit is met name relevant voor verdere studie voorlopercellen in vitro of scheidt hoogwaardige RNA aan het genexpressieprofiel analyseren.
Introduction
Leverregeneratie wordt meestal geassocieerd met de zelfvernieuwingscapaciteit van hepatocyten. Niettemin chronische leveraandoeningen letsels ontstaan met progenitor cel activatie en expansie, die zijn geassocieerd met hun vermogen om te differentiëren in hepatocyten en cholangiocyten 1, 2, 3, 4. Dit is bijzonder relevant omdat, tijdens chronische letsels, hepatocyten proliferatie niet effectief. Ondanks meerdere genetische tracing studies gericht progenitorcellen, hun rol in leverregeneratie blijft controversieel 5, 6, 7, 8. Bovendien heeft het activeren van voorlopercellen in verband gebracht met verhoogde fibrotische respons in de lever, die vragen over hun precieze rol verhoogt tijdens verwondingen 9, 10.
De heterogeniteit van de voorlopercellen compartiment lang gesuggereerd genexpressiestudies dat progenitor cellen die een enkel oppervlak aanwijzer kan microdissectie of celsortering-gebaseerde werkwijzen 1, 11 geïsoleerd. Sterker nog, onlangs, een roman oppervlak marker combinatie met behulp van GP38 (podoplanin) eenduidig gekoppeld vorige single markers van stamcellen aan verschillende subgroepen 12. Belangrijk is dat deze subgroepen niet alleen verschilden in oppervlakte marker expressie maar vertoonden functionele veranderingen gedurende 12 verwondingen.
Meerdere dierlijke modellen zijn gebruikt om te onderzoeken voorlopercellen cel activatie en de lever regeneratie. Het lijkt erop dat de verschillende soorten schade bevorderen de activering van verschillende subsets van progenitorcellen 12. Dit kan het ph verklarenenotypic divergentie van de ductulaire reactie waargenomen bij mensen 4. Dus de complexe fenotypische en functionele analyse van progenitorcellen zijn cruciaal voor hun rol in verwondingen en de ware betekenis van ductulaire reactie leverziekten begrijpen.
Naast de oppervlakte marker combinaties, de cruciale verschillen in cel isolatie protocollen verder te compliceren de conclusies op basis van eerdere studies 2. Een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek gericht de rol van stamcellen die sterk verschillen in hun isolatieprotocol (bijvoorbeeld lever dissociatie (enzymcombinatie en duur van het proces), medium dichtheid en centrifugeersnelheid) 2. Een geoptimaliseerde isolatie techniek, een betere leefbaarheid voor zeldzame celpopulaties en een afspiegeling is van subgroep samenstelling, is ontwikkeld en onlangs 12 gepubliceerd. Het doel van dit artikel is om een meer det biedenailed protocol van deze levercel isolatiewerkwijze en deelanalyse om de juiste reproductie van de techniek. Bovendien, het protocol bevat een vergelijking met de vorige isolatiewerkwijze de verschillen met het nieuwe protocol demonstreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leverontsteking en schade van verschillende oorsprong leiden regeneratieve processen in de lever die gepaard gaan met progenitorcelexpansie en activering 2, 3. Deze progenitorcellen bezitten stamcel kenmerken en waarschijnlijk een belangrijke rol bij het ontrafelen voor verschillende leverziekten spelen.
De heterogeniteit van leverprogenitorcellen is al lang gesuggereerd. De herbeoordeling van de lever voorlopercellen subsets met beh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Alexander von Humboldt Stichting Sofja Kovalevskaja Award uit aan VLK.
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
References
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
