肝损伤都伴随着祖细胞扩张表示异质细胞群。这种蜂窝室的新颖分级允许多个子集的区别。此处所描述的方法示出了流式细胞术分析,并且可用于进一步的测定各种子集的高纯度分离的流动。
在慢性肝损伤,祖细胞在称为胆管反应过程中,这也需要炎性细胞浸润和上皮细胞活化的外观扩大。这种炎症反应过程中的祖细胞群体大多被用单表面标志物的调查,无论是组织学分析或通过流式细胞仪为基础的技术。然而,新的表面标志物识别的肝脏祖内的各种不同功能的子集/干细胞室。这里提出的方法描述了分离和详细流式细胞使用新型表面标记组合祖亚群分析。此外,它说明了如何在各种祖细胞亚群可与使用自动磁性高纯度和FACS分选的基础的方法进行分离。重要的是,肝脏的新颖的和简化的酶解允许这些稀有细胞群的具有高可行性的隔离即,相较于其他现有方法优越。这是为进一步研究祖细胞在体外或用于分离高质量的RNA来分析基因表达谱尤其相关。
肝再生大多与肝细胞的自我更新的能力相关联。然而,发生与祖细胞活化和扩展,已用其分化成肝细胞和胆管1,2,3,4能力有关的慢性肝损伤。这一点尤其重要,因为,在慢性损伤,肝细胞增殖效果不好。尽管针对祖细胞多基因遗传跟踪研究,他们在肝再生的作用仍然是有争议的5,6,7,8。此外,祖细胞的活化已被链接到在肝脏增加纤维化反应,其损伤9中提出了关于他们的确切作用的问题,10。
祖细胞室的异质性早已被分离出来的使用显微切割或细胞分选基方法1,11表示一个单一的表面标志物前体细胞基因表达研究建议。事实上,最近,一种新的使用表面标志物结合GP38(podoplanin)毫不含糊地挂钩祖细胞的以往单一标记各种子集12。重要的是,这些子集不仅在不同的表面标志物的表达,但伤病期间12还展出了功能改变。
多种动物模型已被用于研究祖细胞的活化和肝再生。似乎各种损伤类型促进不同祖细胞12的子集的激活。这或许可以解释的pH值在人类4观察胆小管反应enotypic分歧。因此,祖细胞的复杂表型和功能分析是枢转,以了解他们在损伤作用和肝脏疾病的导管状反应的真实意义。
除了表面标志的组合,在细胞分离协议的重要区别还基于先前的研究2的结论变得复杂。的研究中的一个显着量寻址祖细胞,在其分离方案有很大的不同( 例如,肝解离(酶组合和处理的持续时间),密度介质,并且离心速度)的作用2。优化的隔离技术,为罕见的细胞群提供更好的生存能力和反射的子集组成,已开发并于最近公布的12。本文的目的是提供一个更DET这种肝细胞分离过程和所述子集分析ailed协议以允许该技术的适当的再现。此外,该协议包括与以前的分离方法来证明相比,新的协议的差异的比较。
肝脏炎症和不同来源的损伤触发在于伴随着祖细胞扩增和活化2,3肝再生过程。这些肝祖细胞具有干细胞的特性,并可能发挥各种肝病的病理机制一个显著的作用。
肝祖细胞的异质性早已被建议。使用CD133和GP38的新型表面标记组合可以识别携带不同表面标志的子集,并表示肝损伤12中唯一的一组炎症相关基因的肝脏?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由亚历山大·冯·洪堡基金会Sofja Kovalevskaja奖VLK支持。
RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |