Utarbeidelse av CD4<sup> +</sup> T celler for analyse av GD3 og GD2 Gangliosid Membran Expression ved mikroskopi
Summary
Vi beskriver en standard antistoffarging protokoll for bruk ved mikroskopi for å bestemme membranen ekspresjon og lokalisering av gangliosider i hvilende og aktiverte humane naive CD4 + T-celler. Det er også beskrevet real-time PCR eksperimenter ved hjelp av <40000 celler som ikke krever ekstra lave innspill RNA kits.
Abstract
Fremgangsmåtene beskrevet heri for aktivering av naive CD4 + T-celler i suspensjon og deres tilslutning i dekkglass for konfokal mikroskopi-analyse tillate den romlige lokalisering og visualisering av gangliosider som er involvert i CD4 + T-celleaktivering, som utfyller uttrykk profilering eksperimenter som flowcytometri, western blotting eller real-time PCR. Kvantifisering av gangliosid uttrykk ved strømningscytometri og deres cellulære lokalisering ved hjelp av mikroskopi kan oppnås ved bruk av anti-gangliosid-antistoffer med høy affinitet og spesifisitet. Ikke desto mindre en tilstrekkelig behandling av celler i suspensjon innbefatter behandling av kulturplater for å fremme den nødvendige tilslutning kreves for fluorescens eller konfokal mikroskopi anskaffelse. I dette arbeidet, beskriver vi en protokoll for å bestemme GD3 og GD2-gangliosid uttrykk og colocalization med TCR i løpet av naive CD4 + T-celleaktivering. Også real-time PCR eksperimenter ved hjelp av <40.000 celler er beskrevet for bestemmelse av GD3 og GM2 / GD2-syntase-gener, noe som viser at genet analyse eksperimenter kan utføres med et lavt antall celler og uten behov for ekstra lave inngangs RNA kits.
Introduction
CD4 + T-celler organisere immunresponsen gjennom sine effektorfunksjoner etter aktivering av antigen-presenterende celler 1. Studiet av de cellulære mekanismer som er modulert under aktivering tillater innsyn i en grunnleggende prosess med immunfunksjon. Imidlertid kan studiet av naive CD4 + T-celler være komplisert fordi de representerer en meget liten populasjon av celler i blodet periferien 2.
Gjennom fluorescensmikroskopi flere rapporter har studert for lokalisering av forskjellige molekyler som er involvert i CD4 + T-celleaktivering, i hovedsak proteiner forbundet til plasmamembranen 3. Gangliosidene er sialinsyre-inneholdende glykosfingolipider og selv om de har blitt omfattende studert i nerveceller, hvor de er rikelig, andre celler, for eksempel immunceller som også uttrykker gangliosider med biologisk relevante funksjoner 4,5. Vi har tidligere rapportert that ved aktivering av humane naive CD4 + T-celler er det en oppregulering av den α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 syntase) og GM2 / GD2-syntase, som induserer den betydelige overflate neoexpression av GD2 og oppregulering av GD3 gangliosid 6. Videre studier av GD3, GD2 og andre gangliosider i immunceller er nødvendig for å utfylle en proteinbasert delvis utsikt over immunforsvar.
Vanligvis blir studiet av gangliosidet uttrykk basert på teknikker, slik som tynnsjiktskromatografi (TLC) 7, men denne teknikken tillater ikke den romlige lokalisering av gangliosider ved plasmamembranen, eller i subcellulære kamre, noe som begrenser biologisk analyse.
I dette arbeidet, beskriver vi en protokoll for antistoff-mediert identifikasjon og lokalisering av GD3 og GD2 gangliosider i humane naive CD4 + T-celler og PBMC etter at anti-CD3 / anti-CD28-aktivering. Med denne protokollen det jegs også mulig å analysere genet og molekyl ekspresjon av gangliosider i et lavt antall celler i suspensjon, med anskaffelse av bilder av høy kvalitet 6, tatt i betraktning den lille størrelsen av lymfocytter (9 um).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokoll kan benyttes for å lokalisere gangliosider eller proteiner i cellesuspensjoner av CD4 + T-celler eller andre immune celler (f.eks PMBCs, figur 5) ved å starte fra et lite antall celler. På grunn av den lille størrelsen på T-celler og ikke-heftende egenskapene, oppkjøp av fluorescens mikroskopiske bilder gir dårlig informasjon eller lav kvalitet hvis cellene er ikke riktig overholdt.
Denne protokollen kombinert med en god kva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
