Preparazione di CD4<sup> +</sup> Le cellule T per l'analisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio
Summary
Descriviamo un protocollo di colorazione degli anticorpi standard per l'uso in microscopia per determinare l'espressione di membrana e la localizzazione di gangliosidi a riposo e ingenuo cellule T CD4 + attivate umani. sono descritte anche in tempo reale esperimenti di PCR utilizzando <40.000 cellule che non necessitano di ulteriori kit a basso RNA ingresso.
Abstract
I metodi qui descritti per l'attivazione delle cellule T CD4 + naive in sospensione e la loro adesione a lamelle per l'analisi al microscopio confocale consentono la localizzazione spaziale e la visualizzazione dei gangliosidi coinvolti nella attivazione delle cellule T CD4 +, che l'espressione di complemento profiling esperimenti come la citometria a flusso, occidentale assorbente o real-time PCR. La quantificazione di espressione ganglioside tramite citometria di flusso e la loro localizzazione cellulare mediante microscopia può essere ottenuta con l'uso di anticorpi anti-gangliosidi con alta affinità e specificità. Tuttavia, una adeguata gestione delle cellule in sospensione comporta il trattamento di piastre di coltura per promuovere l'adesione necessaria richiesta per la fluorescenza o acquisizione microscopia confocale. In questo lavoro, si descrive un protocollo per la determinazione GD3 e GD2 espressione ganglioside e colocalization con il TCR durante l'attivazione ingenuo cellule T CD4 +. Inoltre, real-tesperimenti ime PCR utilizzando <40.000 cellule sono descritti per la determinazione del GD3 e geni sintasi GM2 / GD2, dimostrando che gli esperimenti di analisi gene possono essere eseguite con un basso numero di cellule e senza la necessità di ulteriori kit bassa RNA ingresso.
Introduction
Le cellule T CD4 + orchestrare la risposta immunitaria attraverso le loro funzioni effettrici dopo l'attivazione da parte delle cellule presentanti l'antigene 1. Lo studio dei meccanismi cellulari che vengono modulati durante l'attivazione permette spaccato un processo di base della funzione immunitaria. Tuttavia, lo studio delle cellule T CD4 + naive può essere complicato perché rappresentano una piccola frazione di cellule nella periferia del sangue 2.
Attraverso la microscopia a fluorescenza diversi rapporti hanno studiato la localizzazione di diverse molecole coinvolte nella attivazione delle cellule T CD4 +, principalmente proteine associate alla membrana plasmatica 3. I gangliosidi sono glicosfingolipidi acido sialico che contiene e, anche se sono stati ampiamente studiati nelle cellule nervose dove sono abbondanti, altre cellule, come le cellule immunitarie esprimono anche gangliosidi con funzioni biologicamente rilevanti 4,5. Abbiamo precedentemente riportato that durante l'attivazione delle cellule T CD4 + naive umane vi è un up-regolazione del α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 sintasi) e la sintasi GM2 / GD2, che inducono il significativo neoexpression superficie GD2 e l'up-regolazione di GD3 ganglioside 6. Ulteriori studi di GD3, GD2 e altri gangliosidi nelle cellule immunitarie è necessario per completare una vista parziale a base di proteine della funzione immunitaria.
Comunemente, lo studio dell'espressione ganglioside si basa su tecniche quali la cromatografia su strato sottile (TLC) 7, ma questa tecnica non consente la localizzazione spaziale dei gangliosidi a livello della membrana plasmatica o in compartimenti subcellulari, limitando analisi biologiche.
In questo lavoro, si descrive un protocollo per l'identificazione anticorpo-mediata e la localizzazione di GD3 e GD2 gangliosidi nelle cellule T CD4 + naive umani e PBMC dopo l'attivazione anti-CD28 anti-CD3 /. Con questo protocollo è is anche possibile analizzare l'espressione genica e molecolare di gangliosidi in un basso numero di cellule in sospensione, con l'acquisizione di immagini di alta qualità 6, considerando le piccole dimensioni dei linfociti (9 micron).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare gangliosidi o proteine in sospensioni cellulari di cellule T CD4 + o altre cellule immunitarie (ad esempio, PMBCs, Figura 5) a partire da un piccolo numero di cellule. A causa delle piccole dimensioni di cellule T e proprietà antiaderenti, l'acquisizione di fluorescenza immagini microscopiche comporta informazioni scarsa o bassa qualità se le cellule non siano rispettati correttamente.
Q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
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