הכנת CD4<sup> +</sup> T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית
Summary
אנו מתארים פרוטוקול מכתים נוגדן תקן לשימוש במיקרוסקופ כדי לקבוע את ביטוי הקרום ולוקליזציה של gangliosides ב מנוחה ותאי T מסוג CD4 + נאיביים אדם הופעל. כמו כן תארו הם ניסויים בזמן אמת באמצעות PCR <40,000 תאים שאינם דורשים ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.
Abstract
השיטות שתוארו לעיל לצורך הפעלה של תאים נאיביים CD4 + T השעיה ואת דבקותם ב coverslips לניתוח מיקרוסקופיה confocal לאפשר לוקליזציה מרחבים ובראייה של gangliosides מעורב הפעלת תא CD4 + T, כי ביטוי המשלים פרופיל ניסויים כגון cytometry זרימה, מערבי סופג או בזמן אמת PCR. כימות של ביטוי ganglioside דרך cytometry זרימת לוקליזציה הסלולר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה ניתן להשיג על ידי השימוש של נוגדנים נגד ganglioside עם זיקה גבוהה וספציפי. עם זאת, גידול טיפול הולם של תאים בתרחיף כרוך בטיפול צלחות התרבות לקדם את דבקות הנדרשות עבור קרינה או רכישת מיקרוסקופיה confocal. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לקביעת ביטוי ganglioside GD3 ו GD2 ו colocalization עם TCR במהלך הפעלת CD4 + T תאים נאיבית. כמו כן, אמת tIME PCR ניסויים באמצעות <40,000 תאים מתוארים ביחס קביעת GD3 ו GM2 / GD2 גני synthase, הוכחה כי ניסויים בניתוח גנטי יכול להתבצע עם מספר נמוך של תאים וללא הצורך של ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.
Introduction
תאי CD4 + T לתזמר את התגובה החיסונית באמצעות פונקציות המפעיל שלהם לאחר הפעלה על ידי תאי מציגי אנטיגן 1. המחקר של המנגנונים התאיים הם מווסתים במהלך ההפעלה מאפשר תובנה תהליך בסיסי של תפקוד מערכת חיסון. עם זאת, המחקר של תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מסובך, כי הם מייצגים אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים בפריפריה דם 2.
באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספר דיווחים לומדים את הלוקליזציה של מולקולות שונות מעורבים הפעיל תא T מסוג CD4 +, בעיקר חלבונים הקשורים קרום הפלזמה 3. Gangliosides הם המכילים חומצה sialic glycosphingolipids ולמרות שהם נחקרו רבות בתאי עצב היכן הם נמצאים בשפע, תאים אחרים כגון תאי מערכת החיסון גם להביע gangliosides עם פונקציות רלוונטיות מבחינה ביולוגית 4,5. בעבר דיווחנו that במהלך ההפעלה של תאים אנושיים נאיבי CD4 + T קיימת הגברת הביטוי של α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (synthase GD3) ואת synthase GM2 / GD2, כי לגרום neoexpression משטח משמעותי GD2 ואת הגברת הביטוי של GD3 ganglioside 6. מחקר נוסף של GD3, GD2 ו gangliosides האחר בתאי מערכת חיסוניים יש צורך להשלים נוף חלק המבוסס על חלבונים של תפקוד מערכת חיסון.
בדרך כלל, המחקר הביטוי ganglioside מבוסס על טכניקות כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 7, אבל טכניקה זו אינה מאפשרת לוקליזציה המרחבי של gangliosides על הממברנה פלזמה או בתאים subcellular, הגבלת ניתוח ביולוגי.
בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בתיווך נוגדנים ולוקליזציה של gangliosides GD3 ו GD2 בתאים אנושיים נאיבי CD4 + T ו PBMCs לאחר הפעלת אנטי CD3 / אנטי CD28. עם i זה בפרוטוקול זהגם אפשרי לנתח את הגן והביטוי המולקולרי של gangliosides במספר נמוך של התאים בתרחיף, עם הרכישה של תמונות באיכות גבוהה 6, בהתחשב בגודל קטן של לימפוציטים (9 מיקרומטר).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי לבצע לוקליזציה gangliosides או חלבונים השעיות התא של תאי CD4 + T או תאי חיסון אחרים (למשל, PMBCs, איור 5) החל ממספר קטן של תאים. בגלל גודלו הקטן של תאי T ומאפיינים לא חסידים, רכישת תוצאות תמונות מיקרוסקופיות קרינת מידע עני או באיכו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
