إعداد CD4<sup> +</sup> خلايا T للتحليل GD3 وGD2 غانغليوزيد غشاء التعبير بواسطة الميكروسكوب
Summary
نحن تصف بروتوكول تلوين الأجسام المضادة القياسية لاستخدامها في المجهر لتحديد التعبير الغشاء وتوطين gangliosides في الراحة والسذاجة خلايا CD4 + T الإنسان تفعيلها. كما وصفت هي في الوقت الحقيقي التجارب PCR باستخدام <40000 الخلايا التي لا تتطلب معدات إضافية منخفضة الدخل الحمض النووي الريبي.
Abstract
الطرق الموضحة في هذه الوثيقة لتنشيط خلايا CD4 + T ساذجة في تعليق وتمسكهم في coverslips لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر تسمح للتوطين المكاني وتصور gangliosides تشارك في تنشيط الخلايا CD4 + T، هذا التعبير تكملة التنميط التجارب مثل قياس التدفق الخلوي، غرب النشاف أو في الوقت الحقيقي PCR. الكمي التعبير غانغليوزيد من خلال التدفق الخلوي وتوطين الخلوية من خلال الفحص المجهري يمكن الحصول عليها عن طريق استخدام أجسام مضادة لمكافحة غانغليوزيد مع قابلية عالية وخصوصية. ومع ذلك، والمناولة المناسبة للخلايا في تعليق يتضمن علاج لوحات الثقافة لتعزيز الالتزام اللازم لمضان أو اكتساب المجهر متحد البؤر. في هذا العمل، ونحن تصف بروتوكول لتحديد GD3 وGD2 التعبير غانغليوزيد وcolocalization مع TCR خلال السذاجة تنشيط الخلايا CD4 + T. أيضا، الحقيقي رووصف التجارب IME PCR باستخدام <40000 خلايا لتحديد GD3 والجينات سينسيز GM2 / GD2، مما يدل على أن يمكن القيام بها مع عدد قليل من الخلايا ودون الحاجة إلى مجموعات إضافية منخفضة الدخل RNA تجارب التحليل الجيني.
Introduction
خلايا CD4 + T تنسق الاستجابة المناعية من خلال وظائف المستجيب على بعد التنشيط بواسطة مستضد الخلايا 1. دراسة الآليات الخلوية التي يتم التضمين خلال تفعيل تتيح نظرة ثاقبة على العملية الأساسية لجهاز المناعة. ومع ذلك، فإن دراسة خلايا CD4 + T ساذجة يمكن أن تكون معقدة لأنها تمثل السكان قليل جدا من الخلايا في محيط الدم 2.
من خلال الفحص المجهري مضان درسوا عدة تقارير توطين الجزيئات المختلفة المشاركة في تنشيط الخلايا CD4 + T، أساسا البروتينات المرتبطة الغشاء البلازمي 3. وgangliosides وحمض تحتوي على الشحميات السفنغولية السكرية اللعابي وعلى الرغم من أنها قد درس على نطاق واسع في الخلايا العصبية حيث هم وفيرة، وخلايا أخرى مثل الخلايا المناعية التعبير أيضا gangliosides مع وظائف ذات الصلة بيولوجيا 4،5. ذكرنا سابقا ثار خلال تنشيط خلايا CD4 + T ساذجة الإنسان هناك upregulation من α2،8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 سينسيز) وسينسيز GM2 / GD2، التي تحفز neoexpression سطح كبيرة من GD2 وupregulation من GD3 غانغليوزيد 6. مزيد من الدراسة من GD3، GD2 وgangliosides آخرين في الخلايا المناعية ضرورية لاستكمال وجهة نظر البروتين على أساس جزئي وظيفة المناعة.
عادة، ويستند دراسة التعبير غانغليوزيد على تقنيات مثل اللوني طبقة رقيقة (TLC) 7، ولكن هذه التقنية لا تسمح للتوطين المكاني للgangliosides في غشاء البلازما أو في مقصورات التحت خلوية، والحد من التحليل البيولوجي.
في هذا العمل، ونحن تصف بروتوكول لتحديد الأجسام المضادة التي تتوسط وتوطين GD3 وGD2 gangliosides في السذاجة خلايا CD4 + T الإنسان وPBMCs بعد مكافحة CD3 / تفعيل مكافحة CD28. مع هذا البروتوكول هو أناالممكن أيضا لتحليل الجينات والتعبير الجزيئي للgangliosides في عدد قليل من الخلايا في تعليق، مع الحصول على صور ذات جودة عالية 6، بالنظر إلى حجم صغير من الخلايا الليمفاوية (9 ميكرون).
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول صفها يمكن استخدامها لتوطين gangliosides أو البروتينات في تعليق خلية من خلايا CD4 + T أو الخلايا المناعية الأخرى (على سبيل المثال، PMBCs، الشكل 5) بدءا من عدد صغير من الخلايا. ونظرا لصغر حجم خلايا T وخصائص غير ملتصقة، واقتناء مضان الصور المجهرية النتا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
