Préparation des cellules CD4<sup> +</sup> Cellules T pour l'analyse de GD3 et GD2 ganglioside Membrane Expression par Microscopie
Summary
Nous décrivons un protocole anticorps coloration standard pour une utilisation en microscopie pour déterminer l'expression de la membrane et la localisation des gangliosides dans repos et les cellules T CD4 + activés humains naïfs. On décrit également des expériences de PCR en temps réel en utilisant <40.000 cellules qui ne nécessitent pas de kits supplémentaires d'ARN d'entrée faible.
Abstract
Les procédés décrits ici pour l' activation de cellules T CD4 + naïves en suspension et leur adhérence à lamelles pour une analyse par microscopie confocale permettent la localisation spatiale et la visualisation des gangliosides impliqués dans l' activation des lymphocytes T CD4 + que l' expression du complément de profilage des expériences telles que la cytométrie de flux, occidental buvard ou PCR en temps réel. La quantification de l'expression des gangliosides par cytométrie de flux et de leur localisation cellulaire par microscopie peut être obtenue par l'utilisation d'anticorps anti-ganglioside avec une haute affinité et spécificité. Néanmoins, un traitement adéquat des cellules en suspension implique le traitement des plaques de culture pour promouvoir l'adhérence nécessaire requis pour la fluorescence ou l'acquisition de la microscopie confocale. Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour déterminer GD3 et GD2 expression de ganglioside et colocalisation avec le TCR lors de l' activation naïve de lymphocytes T CD4 +. Aussi, real-texpériences ime PCR en utilisant <40.000 cellules sont décrites pour la détermination de la GD3 et des gènes de synthase GM2 / GD2, ce qui démontre que les expériences d'analyse de gène peut être réalisé avec un faible nombre de cellules, et sans qu'il soit nécessaire de kits supplémentaires d'ARN d'entrée bas.
Introduction
Les cellules T CD4 + orchestrer la réponse immunitaire par l' intermédiaire de leurs fonctions effectrices après activation par les cellules présentant l' antigène 1. L'étude des mécanismes cellulaires qui sont modulés lors de l'activation permet un aperçu d'un processus de base de la fonction immunitaire. Cependant, l'étude des cellules T CD4 + naïfs peut être compliqué , car ils représentent une très petite population de cellules dans la périphérie de sang 2.
Grâce à la microscopie par fluorescence à plusieurs rapports ont étudié la localisation de différentes molécules impliquées dans l' activation des lymphocytes T CD4 +, principalement des protéines associées à la membrane plasmique 3. Les gangliosides sont des glycosphingolipides contenant de l' acide sialique , et même si elles ont été largement étudiées dans les cellules nerveuses où ils sont abondants, d' autres cellules telles que les cellules immunitaires expriment également des gangliosides avec des fonctions pertinentes biologiquement 4,5. Nous avons précédemment rapporté that lors de l' activation des cellules naïves humaines T CD4 + il y a une régulation positive de l'α2,8 sialyltransférase ST8Sia 1 (GD3 synthase) et la synthase GM2 / GD2, qui induisent la neoexpression de surface importante de GD2 et la régulation positive de ganglioside GD3 6. Une étude plus poussée de GD3, GD2 et d'autres gangliosides dans les cellules immunitaires est nécessaire pour compléter une vue partielle de la fonction immunitaire à base de protéines.
Généralement, l'étude de l' expression des gangliosides est basée sur des techniques telles que la Chromatographie sur couche mince (CCM) 7, mais cette technique ne permet pas la localisation spatiale de gangliosides à la membrane plasmique ou dans des compartiments sub – cellulaires, en limitant l' analyse biologique.
Dans ce travail, nous décrivons un protocole pour l'identification d'anticorps médiée et la localisation de GD3 et GD2 gangliosides dans les cellules CD4 + T naïfs humains et CMSP après anti-CD3 / activation anti-CD28. Avec ce protocole, il is également possible d'analyser l'expression génique et moléculaire de gangliosides dans un faible nombre de cellules en suspension, avec l' acquisition d'images de haute qualité 6, compte tenu de la petite taille des lymphocytes (9 pm).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser les gangliosides ou de protéines dans des suspensions cellulaires de lymphocytes T CD4 + ou d' autres cellules du système immunitaire (par exemple, PBMC, figure 5) à partir d'un petit nombre de cellules. En raison de la petite taille des cellules T et les propriétés non-adhérentes, l'acquisition de fluorescence images microscopiques résultats dans une mauvaise information ou de faible qualité si les cellules …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
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