Bereiding van CD4<sup> +</sup> T cellen voor analyse van GD3 ganglioside GD2 en Membraanexpressie door Microscopie
Summary
We beschrijven een standaard protocol antilichaam kleuring voor microscopie aan het membraan expressie en localisatie van gangliosiden in rustende en geactiveerde humane naïeve CD4 + T-cellen te bepalen. Ook beschreven zijn real-time PCR experimenten met <40.000 cellen die geen extra lage input RNA kits vereisen.
Abstract
De hierin beschreven voor activering van naïeve CD4 + T-cellen methoden in suspensie en de hechting in dekglaasjes confocale microscopie analyse kan de ruimtelijke lokalisatie en visualisatie van gangliosiden die deze CD4 + T-cel activatie, die complement expressieprofielen experimenten zoals flowcytometrie, Western blotting of real-time PCR. De kwantificering van ganglioside expressie door middel van flowcytometrie en hun cellulaire lokalisatie door middel van microscopie kan worden verkregen door het gebruik van anti-ganglioside antilichamen met hoge affiniteit en specificiteit. Desalniettemin, een goede behandeling van cellen in suspensie omvat de behandeling van kweekplaten de nodige hechting vereist voor fluorescentie of confocale microscopie verwerving promoten. In dit werk beschrijven we een protocol voor het bepalen en GD3 ganglioside GD2 expressie en colokalisatie met de TCR in naïeve CD4 + T-cel activatie. Ook real-time PCR experimenten met <40.000 cellen beschreven voor het bepalen van de GD3 en GM2 / GD2 synthase genen, waaruit blijkt dat gen analyse experimenten kunnen worden uitgevoerd met een gering aantal cellen en zonder dat extra lage input RNA kits.
Introduction
De CD4 + T-cellen orkestreren de immuunrespons door hun effectorfuncties na activering door antigen presenterende cellen 1. De studie van de cellulaire mechanismen die gemoduleerd bij activering zorgt inzicht in een basisproces van immuunfunctie. Echter, de studie van naïeve CD4 + T-cellen worden gecompliceerd omdat zij een zeer kleine populatie van bloedcellen periferie 2.
Door fluorescentiemicroscopie verscheidene rapporten de lokalisatie van verschillende moleculen die betrokken zijn bij CD4 + T-cel activatie, voornamelijk geassocieerde eiwitten naar de plasmamembraan 3 bestudeerd. De gangliosiden siaalzuur bevattende glycosfingolipiden en hoewel ze zijn uitgebreid bestudeerd in zenuwcellen wanneer zij overvloedig, andere cellen zoals immuuncellen ook aangeven gangliosiden met biologisch relevante functies 4,5. We eerder gemeld that tijdens activatie van naïeve CD4 + T-cellen er een opregulatie van de α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 synthase) en de GM2 / GD2 synthase induceren dat het aanzienlijke oppervlak van neoexpression GD2 en GD3 ganglioside opregulatie van 6. Nader onderzoek van GD3, GD2 en andere gangliosiden immuuncellen dient een eiwit gebaseerde gedeeltelijke weergave van immuunfunctie vullen.
Gewoonlijk is de studie van ganglioside expressie gebaseerd op technieken zoals dunnelaagchromatografie (TLC) 7, maar deze techniek niet de ruimtelijke lokalisatie van gangliosiden toe op het plasmamembraan of in subcellulaire compartimenten beperken biologische analyse.
In dit werk beschrijven we een protocol voor de antilichaam gemedieerde identificatie en lokalisatie van GD3 en GD2 gangliosiden in naïeve humane CD4 + T-cellen en PBMC's na anti-CD3 / anti-CD28 activatie. Met dit protocol is iook mogelijk om het gen en moleculaire expressie van gangliosiden analyseren een gering aantal cellen in suspensie met beeldopname hoogwaardige 6, gezien de beperkte omvang van lymfocyten (9 um).
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven protocol kan worden gebruikt om gangliosiden of eiwitten te lokaliseren in celsuspensies van CD4 + T-cellen of andere immune cellen (bijvoorbeeld PMBCs, figuur 5) uitgaande van een klein aantal cellen. Door de geringe omvang van T-cellen en niet-hechtende eigenschappen, de verwerving van fluorescentie microscopische afbeeldingen leidt tot een slechte informatie of lage kwaliteit als de cellen niet correct nageleefd.
Dit protocol gecombineerd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
References
- Mazzon, C., Viola, A. From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse. Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).
- Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms. Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).
- Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation. Biomed Res Int. , 276498 (2013).
- Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation. Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).
- Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters. Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).
- Müthing, J. TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids. Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- O’Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).
- Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection. Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).
- Marconi, S., Acler, M., et al. Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients. Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).
- Park, J. E., Wu, D. Y., et al. Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand. Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).
- Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis. Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).
- Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex. J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).
- Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control. Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).
- Yamashiro, S., Okada, M., et al. Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes. Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).
- Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes. Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).
- Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody. J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).
