Summary

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em> Xenopus</em> Böbrek

Published: May 03, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

Xenopus laevis (kurbağa), pronephros, embriyonik böbrek tek nefron oluşur ve böbrek hastalığı için bir model olarak kullanılabilir. Xenopus embriyolar dışarıdan geliştirmek, büyük ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi işlemler tarafından manipüle edilebilir. Buna ek olarak, kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulmuştur. sonuçta bir organa veya ilgili dokuya sebebiyet verecek bağımsız blastomere hedefli mikroenjeksiyon seçici gelişen embriyonun geri kalan ikincil etkilerin azaltılması, aşın ya da, bu sınırlı bölge içinde gen ekspresyonunu yıkmak kullanılabilir. Bu protokol, biz 4 ve 8 hücreli embriyolar belirli blastomer içine mikroenjeksiyon yoluyla gelişen Xenopus böbrek (pronephros), hedef kurulan Xenopus kader haritaları nasıl kullanılacağını açıklar. soy izleyicilerin enjeksiyon enjeksiyon spesifik hedefleme doğrulamasına imkan sağlar.Embriyolar 38 evresine kadar gelişti sonra – 40 tüm montaj immün Pronephric gelişimi görselleştirmek için kullanılır ve pronephros hedeflenen hücrelerin katılım değerlendirilebilir. Aynı teknik pronephros ilave olarak diğer doku tiplerini hedef uyarlanabilir.

Introduction

Xenopus embriyonik böbrek, pronephros, böbrek gelişimini ve hastalığın incelemek için iyi bir modeldir. Embriyolar, harici olarak geliştirilmesi büyük boyutta, çok sayıda üretilebilir ve kolayca mikroenjeksiyon veya cerrahi prosedürler ile işlenir. Buna ek olarak, memeliler ve amfibiler böbrek gelişimini yöneten genler korunur. Embriyonik amfibiler bir pronephros var ve yetişkin amfibi bir metanephros varken, pronephros, mesonephros ve metanephros 1: Memeli böbrekler üç aşamadan yoluyla ilerleme. Bu, böbrek formlarının temel filtreleme birimi nefron ve memeli ve amfibi hem nefrogenezisi 2, 3 geçmesi, aynı sinyal iletim ve endüktif olaylar. Xenopus pronephros proksimal, orta ve distal tübülleri bağlayan oluşan tek nefron içerir, ve (memeli glomerulus benzer) glomus 1, 4-6 (Şekil 1 </strong>). Xenopus pronephros tek büyük nefron, bu böbrek gelişim ve hastalık süreçlerinde rol oynayan genlerin incelenmesi için basit bir model olarak uygun hale getirir.

Hücre kader haritaları erken Xenopus embriyolar için kurulan ve serbestçe Xenbase 7-11 online olarak mevcuttur edilmiştir. Aynı teknik, kalp ya da gözler gibi diğer hedef dokulara adapte edilebilir, ancak burada, gelişmekte Xenopus pronephros hedef soyu izleyicilerin mikroenjeksiyon için bir teknik açıklanmaktadır. Köken izleyiciler erken blastomere enjekte edilebilir, geliştirme sırasında bu hücre soyu görselleştirme sağlayan (vital boyaların, floresan etiketli dekstranlar, histokimyasal tespit enzimler, ve mRNA floresan proteinleri kodlayan dahil) etiketlerdir. Bu protokol MEM-RFP mRNA kodlama membran soy izleyici olarak, kırmızı floresan proteini 12 hedef kullanır. Hedeflenen Mikroenjeksiyon teknolojiBurada tarif edilen 4- ve 8 hücreli embriyolar bireysel blastomerlerin için bir dizi yöntem vasıtasıyla ilgili bir geni fazla-sentezlemek üzere gen ekspresyonunu veya eksojen RNA ile yıkmak morpholinos enjeksiyon için kullanılabilir. ventral, bitkisel blastomer içine enjekte edilerek, öncelikle embriyo pronephros gelişimsel bir kontrol olarak kontralateral pronephros bırakarak, hedeflenecektir. Bir izleyicinin ko-enjeksiyon doğru blastomere enjekte edildi doğrular ve embriyoda dokular gösterir pronephros hedeflenmesi doğrulayarak, enjekte blastomer ortaya çıktı. pronephros immün Pronephric tübüller hedef alınmıştır ne kadar iyi görselleştirme sağlar. Overekspresyonu ve demonte etkiler daha sonra bir gelişimsel kontrol olarak hizmet veren embriyo, kontralateral tarafa karşı gol olabilir ve Pronephric indeksi 13 hesaplamak için kullanılabilir. hücre kaderinin haritaların temini bu hedefli mikroenjeksiyon tekniği oth hedef dokulara kullanılmasına olanaker pronephros ve, bir floresanlı işaretleyici birlikte enjeksiyon dışında her bir dokuya hedeflenmiş mikroenjeksiyon analiz öncesi doğrulanmasına izin verir.

Embriyo mikroenjeksiyon sırasında, gelişimsel sıcaklık, sıkı regüle Xenopus gelişme oranı o 14 oranda bağımlı olduğu verilmelidir. Geliştirme süresi yavaşlatılır için 4 ve 8-hücresi enjeksiyonu – (16 ° C 14) Embriyolar daha soğuk sıcaklıklarda inkübe edilmelidir. 22 ° C, evre 1 (1 hücreden) kalkınma anda 16 ° C geliştirme anda 3 yaklaşık 4 saattir sahneye iken 3 (4 hücreleri) yaklaşık 2 saattir sahneledi. Bu 22 ° C'de 8 hücreli (evre 4) embriyo için bir 4-hücreli embriyo gitmek için yaklaşık 15 dakika sürer, ancak 16 ° C'de yaklaşık 30 dakika sürer. Benzer bir şekilde, 22 ° C 'de, sadece bir 16 hücreli embriyo (Aşama 5) ilerleme için bir 8-hücreli embriyonun 30 dakika sürer. Bu kez 16 ° C'de 45 dakika için artırılır.refore, embriyolar, 16 hücre aşamasına kadar ilerleme önce, 8-hücre aşamasında enjeksiyon için yeterli zaman sağlamak için embriyo gelişimi hızını yavaşlatmak için yararlıdır. Buna ek olarak, büyüme sıcaklığı hız veya böbrek tam gelişmiş kadar embriyo gelişimini yavaşlatmak için modüle edilebilir.

Iribaş aşamalı Xenopus embriyoların epidermis dokusu 15 diseksiyon veya takas olmadan gelişen pronephros kolay görüntüleme için izin nispeten şeffaftır. Nedeniyle Xenopus embriyoların göreli şeffaflık, canlı hücre görüntüleme de 16,17 mümkündür. Sonra Xenopus embriyolar 18-20 gen ifadesinin manipülasyonu hedeflenen Pronephric gelişmenin değerlendirilmesinde izin 40 embriyolar – pronephros görselleştirmek için immün, orta distal proksimal ve sahnenin bağlantı tübül 38 etiket kurulan antikorlarla mümkündür tüm montaj.

Protocol

(: HSC-AWC-13-135 protokol #) Aşağıdaki protokol Kurumsal Bakım ve Kullanım Kurulu olarak hizmet vermektedir Laboratuar Hayvan Hastalıkları Hayvan Refahı Komitesi için Houston'ın Merkezi'nde Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Böbrek hedefli Enjeksiyonlar için blastomer 1. Kimlik ve Seçimi Embriyoların oluşturmadan önce, embriyo erken hücre bölünmeleri yönünü anlamak için Xenopus Kalkınma 21 Normal Tablo kulla…

Representative Results

MEM-RFP mRNA ile 4 ve 8 hücreli Xenopus embriyoların Microinjections pronephros hedefleme farklı düzeylerde göstermektedir. 4 gösterileri sahne doğru MEM-RFP mRNA ekspresyonu ile 40 embriyolar Şekil. Embriyolar, sol ventral blastomere (Şekil 4A) enjekte ve MEM-RFP mRNA uygun ekspresyon modeli için kriteri edildi. Ara uzak proksimal, MEM-RFP'yi tanımlayan ve böbrek tübülleri bağlanmanın yanı sıra, uygun bir …

Discussion

Xenopus embriyoların geliştirilmesi pronephros Hedefleme belirlenmesi ve doğru blastomer enjekte dayanır. 8 hücreli embriyo V2 blastomer enjeksiyon sol pronephros 18 hedefliyor. Bu bir iç kontrol olarak kontralateral sağ pronephros bırakır. morfolino demonte veya RNA aşırı böbrek gelişimi değiştirmek için kullanıldığı takdirde, kontralateral sağ pronephros sol pronephros gen demonte veya aşırı ekspresyonuna etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu durumda, böy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Texas McGovern Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatri Bölümü'nden Sağlık NIDDK hibe (K01DK092320) ve başlangıç ​​fon Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Sodium chloride Fisher S271-3
Potassium chloride Fisher P217-500
Magnesium sulfate  Fisher M63-500
Calcium chloride Fisher C79-500
HEPES Fisher BP310-500
EDTA Fisher S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mL Amresco E737-20ML
L-Cysteine, 99%+ Acros Organics 52-90-4
Ficoll Fisher BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875712
Mini Fridge II Boekel 260009 Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W. Invitrogen D1817 Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water Corning 46-000-CI
7" Drummond replacement tubes Drummond 3-000-203-G/XL Microinjection needles.
Needle puller Sutter Instruments P-30
Fine forceps Dumont 11252-30 For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II Drummond 3-000-204 Microinjector.
Mineral oil, heavy Fisher CAS 8042-47-5 Oil for needles.
27G monoject hypodermic needle Covidien 8881200508 For loading mineral oil into microinjection needle.
5 mL Luer-Lok syringe BD 309646 For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
800 micron polyester mesh Small Parts CMY-0800-C
Transfer pipets Fisher 13-711-7M For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate Nest Biotechnology
MOPS Fisher BP308-500
EGTA Acros Organics 67-42-5
Formaldehyde Fisher BP531-500
15 mm x 45 mm screw thread vial Fisher 03-339-25B For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell culture plate Nest Biotechnology
Benzocaine Spectrum BE130
Ethanol Fisher BP2818-4
Methanol Fisher A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder Fisher BP661-50
Bovine serum albumen Fisher BP1600-100
Triton X-100 Fisher BP151-500
3D mini rocker, model 135 Denville Scientific 57281
Goat serum, New Zealand origin Invitrogen 16210064
Sodium azide Fisher S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label distal tubule and duct.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit MBL PM005 Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Secondary antibody to label distal tubule and duct.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A21428 Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 cavity spot plate Corning 7220-85
Benzyl benzoate Fisher 105862500 Optional – for clearing embryos
Benzyl alcohol Fisher A396-500 Optional – for clearing embryos

References

  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
  3. Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).
  4. Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  5. Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
  6. Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
  7. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
  8. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  9. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  10. Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann’s Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
  11. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
  12. Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
  13. Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms’ tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).
  15. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. , 215-238 (2014).
  16. Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
  17. Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
  18. Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
  19. Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
  20. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. , (2014).
  21. Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
  22. Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
  23. Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  24. Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
  25. Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
  26. Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
  27. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
  28. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
  29. Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
  30. Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).

Play Video

Cite This Article
DeLay, B. D., Krneta-Stankic, V., Miller, R. K. Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney. J. Vis. Exp. (111), e53799, doi:10.3791/53799 (2016).

View Video