Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему<em> Xenopus</em> почки

Xenopus эмбриональной почки, Предпочка, является хорошей моделью для изучения развития почек и болезней. Эмбрионы развиваются внешне, имеют большие размеры, могут быть получены в больших количествах, и легко манипулировать с помощью микроинъекции или хирургических процедур. Кроме того, гены, регулирующие развитие почек у млекопитающих и земноводных сохраняются. Млекопитающие почки прогрессировать через три этапа: Предпочка, мезонефроса и ¹ вторичной почки, в то время как эмбриональные амфибии имеют Предпочка и взрослые амфибии имеют вторичной почки. Основная фильтрация единица этих форм почек является нефрон, и оба млекопитающих и земноводных требуют те же сигнальные каскады и индуктивные события пройти нефрогенеза ^{2, 3.} Предпочка Xenopus содержит один нефрона , состоящий из проксимального, промежуточного, дистальной и соединительной трубочки, и гломусных (аналог клубочках млекопитающих) ^{1, 4-6} (рис 1 </strОнг>). Один большой нефрона присутствует в предпочки Xenopus делает его пригодным в качестве простой модели для изучения генов , участвующих в процессах развития почек и болезней.

Карты судьбы клеток были созданы для ранних эмбрионов Xenopus, и находятся в свободном доступе в Интернете по адресу Xenbase ^7-11. Здесь мы описываем технику для микроинъекции линиджа трассеров для нацеливания развивающиеся Xenopus пронефрос, хотя и тот же метод может быть адаптирован к целевой других тканей , таких как сердце или глаз. Lineage трейсеры ярлыки (в том числе жизненно важных красителей, флуоресцентно меченных декстранов, гистохимического обнаруживаемых ферментов и мРНК, кодирующие флуоресцентные белки), которые могут быть введены в раннем бластомере, что позволяет визуализировать потомству этой клетки в процессе разработки. Этот протокол использует MEM-RFP мРНК, кодирующий мембранный целевой красный флуоресцентный белок ^12, как клонального трассера. Целенаправленное микроинъекции технологийniques для отдельных бластомеров в 4- и 8-клеточных эмбрионов, описанных здесь, могут быть использованы для инъекций с Morpholinos, чтобы сбить экспрессию гена или экзогенной РНК гиперэкспрессией гена интерес. Путем введения в брюшную, вегетативного бластомере, в первую очередь Предпочка эмбриона будут направлены, в результате чего контралатеральной Предпочка в качестве контроля развития. Co-инъекция трассера проверяет, правильно бластомеров инъецируют, и показывает, какие ткани в эмбрионе возникла из введенного бластомере, проверяя адресности предпочки. Иммуноокрашивание предпочки позволяет визуализировать, как хорошо pronephric трубочки были направлены. Избыточной экспрессии и нокдаун эффекты затем может быть забит против контралатеральной стороне эмбриона, который служит в качестве контроля развития, и может быть использовано для вычисления pronephric ¹³ индекса. Наличие клеточной судьбы карты позволяет этому целенаправленный метод микроинъекции быть использована для целевых тканей OTHэр чем предпочки и совместной инъекции флуоресцентного индикатора позволяет направленно микроинъекции в каждой ткани, чтобы быть проверены перед проведением анализа.

Во время эмбрионального микроинъекции, температура развития должна регулироваться плотно, учитывая , что темпы развития Xenopus сильно зависит от него ^14. Эмбрионы следует инкубировать при более низких температурах (14 – 16 ° С) в течение 4- и 8-клеточных инъекций, так как время развития замедляется. При 22 ° С, время разработки от стадии 1 (1) клетки к стадии 3 (4 ячейки) составляет приблизительно 2 часа, в то время как 16 время разработки ° C до стадии 3 составляет около 4 часов. Она занимает около 15 минут, чтобы перейти от 4-клеточного эмбриона к 8-элементная (стадия 4) эмбриона при 22 ° С, но занимает примерно 30 минут при 16 ° С. Аналогичным образом, при 22 ° С, это займет всего 30 минут для 8-клеточного эмбриона прогрессировать до 16-клеточного эмбриона (стадия 5). На этот раз увеличивается до 45 минут при 16 ° С.refore, полезно, чтобы замедлить скорость развития эмбрионов, чтобы дать достаточно времени для инъекций на 8-клеточной стадии, прежде чем эмбрионы прогрессировать до 16-клеточной стадии. Кроме того, температура роста можно модулировать, чтобы ускорить или замедлить развитие эмбриона, пока почки не полностью развита.

Эпидермис головастика стадии Xenopus эмбрионов является относительно прозрачным, что позволяет легко визуализации развивающихся предпочки без рассечения или очистки ткани ^15. Из – за относительной прозрачности Xenopus эмбрионов, получение изображений живых клеток также возможно ^16,17. Всего монтажа иммунным для визуализации Предпочка можно с установленными антителами , которые маркируют проксимальный, средний, дальний и подсоединению канальцы стадии 38 – 40 эмбрионов , которые позволяют для оценки pronephric развития после целенаправленного воздействия генной экспрессии в Xenopus эмбрионов ^18-20.